PTEN基因對血管平滑肌細胞影響的研究進展

胡曉蔚(綜述)，方五旺(審校)

(皖南醫學院，安徽 蕪湖241000)

1977年，Andreas Grüntzing第一次應用經皮冠狀動脈腔內成形術治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，然而術后再狹窄問題在一定程度上影響了其遠期療效，發生率高達30%～50%，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)是血管壁的主要成分，其增殖及遷移在血管成形術后的再狹窄過程中起重要作用。在藥物洗脫支架時代再狹窄發生率仍可達5% ～ 10%［1，2］。近 年 來，隨著分子生物學技術的飛速發展，人們對再狹窄的認識已深入到基因水平、基因治療，尤其是控制VSMC增殖和遷移的相關基因治療，在當前是一個重要的研究方向。其有可能成為21世紀血管性疾病的一種新的、更有潛力的治療方法。

1 再狹窄機制

VSMC的增殖和遷移是血管成形術后再狹窄發生的最重要機制［3］。Curcio等［4］認為支架的置入機械損傷引發一系列的反應:內皮損傷、血管內膜下的成分暴露;隨后血小板激活，在損傷部位沉積形成血栓，另外，脂質的滲透使巨噬細胞聚集，兩者共同釋放細胞因子、有絲分裂原、趨化因子、血小板源性生長因子、凝血酶、β生長因子、表皮生長因子等;再者血管損傷后引起腫瘤壞死因子、白細胞介素、趨化因子、基質金屬蛋白酶、血管緊縮素釋放增多，三者共同引起VSMC開始增殖，同時VSMC增殖也促進腫瘤壞死因子、白細胞介素、趨化因子、基質金屬蛋白酶、血管緊縮素釋放增多，隨著時間的推移，支架置入后的再狹窄逐漸形成。

由于血管重建術中的血管損傷刺激多種生長因子的復合作用而誘導VSMC的增殖和遷移，進而引起內膜增厚。其病理性增殖主要體現在其表型的轉變，即平滑肌細胞從收縮型向合成型的轉變，表現為復制能力增加，幾乎無收縮能力。中層平滑肌細胞的增殖在血管中膜平滑肌損傷后立即發生，48 h達到高峰，平均4 d，增殖的中層平滑肌細胞通過內彈力膜的網狀孔間隙遷移到內膜，進一步增殖肥大，并由收縮表型轉變為合成表型。在損傷后2個月左右增殖、肥大的平滑肌大量合成，分泌細胞外基質，引起內膜進一步增厚［5］。從基因治療角度調控VSMC的增殖和遷移，是防治再狹窄的一個重要方面。

2 PTEN基因的結構及作用機制

PTEN基因由多功能磷酸酶編碼，是3個研究小組于1997年發現的第1個具有磷酸酶活性的抑癌基因。他們從蛋白結構特征﹑在腫瘤中的突變及調節表達等3個領域進行研究，分別將其命名為PTEN基因，多發性進展期癌突變基因(mutation in multiple advanced cancer 1，MMAC1)和由轉化生長因子β1調節的、上皮細胞富含的磷酸酶基因(TGF-β1regulated and epithelial cell-riched phosphatase，TEP1)。在比較三個基因的cDNA和編碼的蛋白質后證實PTEN/MMACl/TEP1三者為同一種基因。近年來，該基因已成為研究的熱點，也成為今后基因治療的又一潛在途徑。

2．1 PTEN基因的結構 PTEN基因是迄今發現的唯一具有蛋白酯酶和磷酸酶活性的抑癌基因，由N端的磷酸酶結構域、C2結構域及C端的尾部結構域組成。PTEN基因定位于人類染色體10q23，全長218 kb，含有9個外顯子和8個內含子，mRNA長度為5500 bp;5'端有804個核苷酸的非翻譯區，其后有長度為1209個核苷酸組成的開放閱讀框架，編碼一個由403個氨基酸組成的蛋白質。PTEN基因的N末端是主要結構功能區，第5個外顯子的第122～133位氨基酸序列(IHCKAGKGRTG)編碼，與蛋白質絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶催化中心高度同源，典型氨基酸序列為HCXXGXGRXG，表明該區域具有蛋白酪氨酸磷酸酶和雙特異性磷酸酶的功能，是PTEN發揮腫瘤抑制活性的功能區［6］。C2結構域與磷酸酶結構域之間有密切的接觸面，兩者共同組成催化單位，如剪除C2結構域C端少數殘基可使磷酸酶活性完全喪失。C端雖無磷酸酶活性，但對維持PTEN蛋白空間結構的完整性起著重要作用，C端突變的PTEN將失去磷酸酶活性［7］。

2．2 PTEN基因的作用機制 PTEN基因在細胞周期調控、細胞凋亡、黏附和遷移、血管內皮細胞增殖和腫瘤微血管形成及維護免疫系統的穩定等多種生理活動中發揮重要作用［8，9］。其作用機制尚未完全清楚，還有待于進一步研究，在此主要敘述以下3個途徑。

2．2．1 磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3)途徑 研究發現純化的PTEN能使PIP3脫磷酸而轉變為磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol-4，5-triphosphate，PIP2)，而 突 變 型PTEN則引起PIP3的積聚;確立了PIP3是PTEN的重要的生理性底物。PIP3是一些生長因子如胰島素樣生長因子、表皮細胞生長因子信號的第二信使，它激活的信號有助于細胞生存、抑制細胞調亡，其通過脫磷酸作用使PIP3轉變為PIP2，而抑制其活性，阻斷PIP3/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)信號轉導通路。PTEN通過以下途徑發揮作用:①阻斷 PIP3/PKB信號通路，抑制細胞生存，促進細胞凋亡。PKB在調控細胞生存/凋亡中發揮關鍵作用，其激活可抑制凋亡信號，如使β1連鎖蛋白積聚、糖原合成激酶3磷酸化而失活，使凋亡前蛋白BAD(Bcl-2家族成員)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9磷酸化以抑制BAD與Bcl-xL(Bcl-2家族成員)的結合，同時上調生存信號。PTEN使PIP3脫磷酸而阻斷磷脂酰肌醇3位羥基激酶(phos phatidylinositide 3-OH kinase，PI3K)/PKB信號通路，使PKB活性下降，從而使PKB介導的提高細胞生存的效應發生逆轉而促進細胞凋亡。②抑制PI3K/磷脂酞肌醇依賴的激酶1信號通道，調節蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的磷酸化，從而抑制細胞分裂和增殖。PKC信號轉導通路是細胞內一促細胞分裂、增殖途徑，其是一效應依賴的激酶，但其磷酸化途徑仍不十分清楚。目前的研究表明與PI3K有關，PKC的磷酸化可能通過依賴PI3K/磷脂酞肌醇依賴的激酶1的信號途徑［10-12］。

2．2．2 局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)途徑 FAK是一種胞內非受體酪氨酸激酶，其調控的主要模式是通過整合素介導的黏附于細胞外基質而被活化，使FAK酪氨酸磷酸化水平增高，并增加了其磷酸激酶的活性，FAK再作用于絲氨酸蘇氨酸激酶和磷酸酶，最終導致FAK去磷酸化而失活，從而阻斷FAK對絲裂原活化的蛋白激酶的調節，抑制細胞的增殖、浸潤及遷移等［13］。研究發現，PTEN基因通過負向調控黏附過程和直接去磷酸化降低FAK及其下游信號分子p130Cas(p130 Crk-associated substance)酪氨酸磷酸化水平，從而抑制細胞的浸潤、轉移;也可以通過FAK去磷酸化來抑制PI3K的活性，從而抑制PI3K/PKB通路。

2．2．3 絲裂原激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑 MAPK代表一個激酶家族，MAPK的活化是通過一個特殊的蘇氨酸和酪氨酸磷酸化來實現。MAPK的級聯反應將信號由細胞表面傳遞至細胞核，并根據所接受的刺激或涉及的信號途徑的不同來調節細胞增殖、分化和凋亡。PTEN主要抑制胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路，和抑制 MAPK上游MAPK/ERK激酶、Ras蛋白的活化及連接蛋白Shc(是通過cDNA克隆篩選到的編碼SH結構域的基因的蛋白產物)的磷酸化而促進細胞凋亡。Kang-Park等［14］發現，PTEN通過其磷酸酶活性使得PKC、MAPK、MAPK激酶去磷酸化失活，阻斷胰島素樣生長因子信號途徑，最終誘導肝細胞瘤發生凋亡。而PTEN依賴性細胞凋亡可由下游分子 PKB的表達而挽救。2001年，Weng等［15］的研究結果顯示，PTEN主要通過MAPK依賴性胰島素反應途徑抑制體外乳腺癌細胞模型生長。此后他們進一步研究PTEN在乳腺癌細胞株MCF7中的作用時發現，PTEN能有效阻斷胰島素介導的癌基因ETS-2(E-Twenty-Six-2，ETS家族成員)的磷酸化作用，而PTEN的這種阻斷作用在于抑制MAPK家系中的ERK簇，并不影響PKB調控途徑。此外，在某些細胞系中，PTEN依賴性細胞凋亡不可能由PI3K之上游分子表達來獲救，這與PTEN在PIP3水平負調控PI3K/PKB通路相一致。

3 PTEN基因對血管成形術后再狹窄的影響

PTEN基因具有調節細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡以及抑制腫瘤細胞生長、侵襲轉移等主要功能，還在胚胎的生長、發育，細胞黏附和遷移、細胞分化、細胞衰老與凋亡、維護免疫系統的穩定等多種生理活動中發揮重要作用［8，9］。目前關于 PTEN在腫瘤的發生發展中研究較多，而在心血管疾病方面還需要大量的實驗對它的作用及其調控機制進行研究。有證據表明，PTEN顯著抑制損傷后VSMC向傷口的遷移。Schwartzbauer等［16］報道，增加重組腺病毒PTEN基因表達能提高半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3活性和裂解多腺苷二磷酸多聚酶，從而誘導原代新生鼠心肌細胞的凋亡，同時阻斷經PI3K途徑的信號;并發現心肌細胞的肥大同時伴有PKB活性的增加。Dimmeler等［17］報道PTEN基因作用上游的重要增殖信號轉導通路，如磷酸肌醇依賴性激酶的激活，阻斷磷脂結合 PKB活化所必需的結構域，從而抑制VSMC增殖和遷移，增加誘導細胞凋亡。Huang等［18］通過腺病毒體外轉染使兔VSMC過表達PTEN，抑制血小板衍生生長因子、核糖體蛋白質S6激酶、PKB的磷酸化和糖原合酶激酶3α和β，調控VSMC增殖與遷移。Selvendiran等［19］研究發現，在體外人主動脈VSMC和體內大鼠頸動脈球囊損傷模型中，由HO-3867(一種新合成的類姜黃色素)通過上調PTEN的表達調控抑制VSMC增殖和血管再狹窄，HO-3867通過上調PTEN表達和下調基質金屬蛋白酶、核因子κB蛋白，抑制動脈內膜的增生。Huang等［20］使用大鼠頸動脈球囊損傷，然后用重組腺病毒介導的PTEN基因轉染至大鼠頸動脈，證明了PTEN基因過表達抑制內膜增生、誘導細胞凋亡和抑制中膜細胞增殖，主要是通過調節抑制PI3K。Mourani等［21］研究比較胚胎鼠、頸動脈球囊損傷和不做頸動脈球囊損傷的大鼠后PTEN的表達發現，PTEN的活性降低，能抑制體內VSMC的增長率，其機制也主要是負性調控體內的PI3K信號。Garl等［22］在動物頸動脈球囊損傷的模型中，研究了基底膜蛋白多糖和PTEN基因在VSMC生長規律的相關性，證明了基底膜蛋白多糖介導PTEN基因活性可以抑制VSMC增殖，并用免疫組織法測定假手術和球囊損傷頸動脈組織中時間對PTEN蛋白表達的影響，PTEN蛋白總含量在動脈血管損傷內膜增長檢測到水平顯著升高。與此相反，假手術組PTEN蛋白檢出率相應較低。在術后第2天，VSMC內膜中可以檢測到磷酸化PTEN蛋白，術后4～10 d，大量的磷酸化PTEN蛋白在內膜檢測出，術后14 d，磷酸化PTEN蛋白表達大大減少，而且術后28 d幾乎檢測不到。Koide等［23］在動脈內膜損傷部位的注射腺病毒介導的PTEN和腺病毒介導的乳糖操縱子Z基因進行比較，14 d后組織病理學檢測發現，腺病毒介導的PTEN組較對照組相比能夠明顯減少新內膜形成，減少細胞增殖，促進細胞凋亡，其機制可能部分通過抑制炎性反應，包括抑制巨噬細胞的侵入和炎性因子的表達。

4 小結及展望

PTEN基因的發現被認為是抑癌基因研究領域的又一重要里程碑。PTEN的存在、發現與研究給心血管疾病診治帶來新的思路、線索甚或是突破。目前關于PTEN基因在心血管疾病方面的研究較少，還需要大量的實驗對它的作用及其調控機制進行研究。相信隨著研究的不斷深入，將會更清楚PTEN基因在心血管疾病防治中的作用，為基因治療提供新的思路，PTEN的研究仍任重道遠。

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