高效液相色譜法測定清涼膏中鹽酸小檗堿含量*

呂游春，劉幸平，張興德

(南京中醫藥大學藥學院，210046)

清涼膏是名老中醫丁澤民教授的經驗方，由青黛、血竭、乳香、沒藥、黃連、冰片等組成，為南京市中醫院醫院制劑(批準文號:Z04000824)，已應用二十余年，臨床療效佳［1］。但原標準中沒有規定含量測定方法，質量控制手段過于簡單，制劑質量難以保證。為有效控制制劑質量，筆者以具有清熱燥濕、瀉火解毒功效的黃連為研究對象，并建立高效液相色譜法［2-3］測定其主要成分鹽酸小檗堿含量，為建立該制劑有效的質量控制標準提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SPD-10AVP型高效液相色譜儀(日本島津公司)，HH-S型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)，索氏提取器(東方科儀)。

1.2 試藥 清涼膏(規格:每盒30 g，批號:081124)，鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號:110713-200208)。乙腈為色譜純(MERCK公司)，磷酸為分析純(南京化學試劑有限公司)，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:AKZONOBEL Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5μm)。流動相:乙腈∶0.1%磷酸(25∶75)，柱溫為30 ℃，流速:1.0 mL·min-1，檢測波長:345 nm。

2.2 對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品約6.08 mg，精密稱定后置100 mL量瓶，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得對照品母液。精密量取2 mL對照品母液置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為12.16μg·mL-1的鹽酸小檗堿對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取清涼膏5 g，精密稱定，用濾紙包裹后放入索氏提取器中，加甲醇100 mL，提取4 h后，將提取液過濾濃縮，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度。

2.4 專屬性實驗 按照處方組成，稱取除黃連以外的其余藥味并按照制備工藝制成缺黃連的陰性制劑，同供試品溶液的制備方法制備成陰性供試液。精密移取鹽酸小檗堿對照品溶液、供試品溶液、陰性供試液各10μL，按照“2.1”項色譜條件進樣，測定，在陰性供試液的色譜圖中鹽酸小檗堿相應的保留時間(17.487 min)處無色譜峰，說明陰性對照溶液無干擾(圖1)。

圖1 3種溶液的HPLC色譜圖A.陰性對照品溶液;B.鹽酸小檗堿對照品溶液;C.供試品溶液;1.鹽酸小檗堿

2.5 線性關系考察 取對照品母液，分別稀釋成3.04，6.08，12.16，24.32 和 48.64 μg·mL-1對照品溶液，分別精密移取10μL，按“2.1”項下的色譜條件測定，以峰面積(Y)為縱坐標，以鹽酸小檗堿的質量濃度(X)為橫坐標，得到線性回歸方程:Y=25 352X+36 678(r=0.999 9)。結果表明，鹽酸小檗堿在3.04～48.64μg·mL-1范圍內，濃度與峰面積有良好的線性關系。

2.6 精密度實驗 精密吸取濃度為12.16μg·mL-1鹽酸小檗堿對照品溶液10μL，依法測定5次，RSD為1.68%(n=5)。結果表明進樣的精密度及儀器精密度均較好。

2.7 穩定性實驗 取同一對照品溶液分別于0，2，4，8，12和24 h測定，RSD為2.19%。結果表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.8 重復性實驗 取同批供試品(批號:081124)，平行5份，按供試品溶液同法制備，精密吸取10μL，按“2.1”項下的色譜條件測定。RSD為2.72%(n=5)。

2.9 加樣回收率實驗 取已知含量重復性項下的樣品(批號:081124，含量:29.3 μg·g-1)，平行5 份，分別精密加入濃度為145.92μg·mL-1鹽酸小檗堿對照品溶液0.5 mL，按“2.3”項方法處理，具體結果見表1。平均加樣回收率100.86%，RSD=1.80%。

2.10 樣品含量測定 分別取10批清涼膏制劑約5 g，精密稱定，按“2.3”項方法處理樣品，照“2.1”項色譜條件進行含量測定，結果10批樣品鹽酸小檗堿含量分別為 29.1，29.4，30.1，28.3，27.6，28.5，30.6，31.1，30.2，28.1 μg·g-1，平均含量 29.3 μg·g-1。

3 討論

筆者曾對多種流動相進行實驗，結果表明乙腈∶0.1%磷酸為25∶75時，各色譜峰能達到很好的分離且峰形好。制劑樣品處理常采用超聲提取法、熱回流法等常規提取方法，結果發現索氏提取法比較適合樣品的處理。此方法使軟膏連續不斷地被純溶劑萃取，既節約溶利萃取效率又高。

含量測定時樣品常采用高速離心或微孔濾膜過濾等方法進行處理，但由于清涼膏基質中含有凡士林、液體石蠟等油性成分，易溶于有機溶劑，較難除盡，而干擾制劑的含量測定。參考文獻的處理方式［4-7］，采用冷藏方法進行脫脂效果較好。

［1］ 鄭雪平，王業皇，丁義江，等.清涼膏治療腫痛型外痔的臨床觀察［J］.中國中西醫結合雜志，2007，27(8):719.

［2］ 馬云淑，阮志國，曾德軍.黃連解毒滴丸中主要有效成分的含量測定［J］.遼寧中醫雜志，2000，27(5):228-229.

［3］ 王靜，陸兔林，毛春芹，等.巖黃連藥材的提取工藝研究［J］.醫藥導報，2010，29(3):360-363.

［4］ 尹寧寧，林永強，徐麗華.高效液相色譜(HPLC)法測定冰黃軟膏中鹽酸小檗堿的含量［J］.中國實用醫藥，2009，4，(9):145-146.

［5］ 陳萬里，史蕙.高效液相色譜法測定膚痔清軟膏中鹽酸小檗堿含量［J］.貴陽醫學院學報，2004，29(2):143-144.

［6］ 管慧，李永江，馬建紅.高效液相色譜法測定復方黃連軟膏中鹽酸小聚堿的含量［J］.新疆中醫藥，2007，25(4):81-83.

［7］ 許明哲，尹利輝，胡昌勤.HPLC法測定他克莫司軟膏劑含量及含量均勻度［J］.中國抗生素雜志，2005，30(12):748-751.