乳核內消液微生物限度檢查方法學驗證

蘭鴻，李元宏，楊務彬

(湖北醫藥學院附屬太和醫院藥學部，湖北十堰 442000)

乳核內消液功能主治為疏肝活血，軟堅散結。處方中浙貝母、柴胡、赤芍、夏枯草均具有抑菌作用;按照2010年版《中華人民共和國藥典》一部附錄ⅩⅢC微生物限度檢查法［1］的要求，筆者對乳核內消液進行了細菌數、真菌數和酵母菌數測定，及控制菌大腸埃希菌的檢查，建立微生物限度檢查方法，并加以驗證［2］。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸氣滅菌器(上海申安醫療器械廠)，DNP-9162型電熱恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)，HH·B11·600型電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)，LRH-150B生化培養箱(廣東醫療器械廠)，超凈臺(蘇凈集團安泰公司)。

1.2 培養基 營養瓊脂培養基，玫瑰紅鈉瓊脂培養基，營養肉湯培養基，膽鹽乳糖培養基，膽鹽乳糖發酵培養基，乳糖發酵培養基，改良馬丁培養基，改良馬丁瓊脂培養基，4-甲基傘形花內酯-β-D-葡萄糖苷酸培養基，曙紅亞甲藍瓊脂培養基(四川省食品藥品檢驗所)。

1.3 陽性對照菌 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，大腸埃希菌［CMCC(B)44102］，枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］，白念珠菌［CMCC(F)98001］，黑曲霉菌［CMCC(F)98003］(四川省食品藥品檢驗所)。

1.4 供試品 乳核內消液(四川省新鹿藥業有限公司，批號:100401，100402，100403)。

2 方法與結果

2.1 供試液制備 取供試品10 mL，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為1∶10供試液。

2.2 陽性對照菌液的制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物接種于營養肉湯培養基中，30～35℃培養18 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每毫升含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用;接種白念珠菌的新鮮培養物于改良馬丁瓊脂培養基中，25℃培養24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每毫升含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用;接種黑曲霉菌的新鮮培養物于改良馬丁瓊脂斜面培養基上，25℃培養5 d，加入含容積分數為0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液5 mL將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管內，用含容積分數為0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每毫升含孢子數50～100 cfu的孢子懸液，備用［3］。

2.3.1 常規法 取供試液1 mL注入平皿。

2.3.2 培養基稀釋法 第一法:取供試液1 mL注入5個平皿中(每個平皿0.2 mL);第二法:取供試液1 mL注入10個平皿中(每個平皿0.1 mL)。

2.3.3 薄膜過濾法 取供試液10 mL，加至pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中，混勻，薄膜過濾，總沖洗量為300 mL。

2.4 回收率實驗

2.4.1 實驗組 取規定量供試液及各實驗菌50～100 cfu，分別注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養基，平行制備2個平皿，凝固后，置規定溫度下，細菌培養24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培養48～72 h。

2.4.2 菌液組 取各實驗菌50～100 cfu注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，平行制備2個平皿，凝固后，置規定溫度下，細菌培養24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培養48～72 h，測定所加入的實驗菌數。

2.4.3 供試品對照組 取規定量供試液，立即傾注瓊脂培養基，凝固后，置規定溫度下，細菌培養24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培養48～72 h，測定供試品本底菌數。

2.4.4 稀釋劑對照組 取稀釋劑pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 mL和實驗菌50～100 cfu，分別注入同一平皿中，考察稀釋劑對實驗有無干擾［4］。

2.4.5 回收率的計算 回收率(%)=(實驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數×100%。

馬克思主義認為公共產品供給方式與生產力的發展水平是呈正相關的，當社會經濟發展水平低的時候，公共產品供給方式比較單一，而當社會經濟發展水平較高時，就可以采取多種方式實現公共服務供給［8］179。在《不列顛在印度的統治》中，馬克思通過對東西方節約用水和共同用水方式比較，得出在西方經濟發展高的國家除采取政府供給方式外還可以采取私人企業家聯合供給的方式，而在東方則由于工業文明程度低，只能采用政府單一供給的方式。

2.5 稀釋劑干擾實驗 使用常規法對稀釋劑進行回收率實驗，結果稀釋劑對照組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉菌平均回收率分別為94.5%，105.3%，98.9%，95.8%，93.3%，表明稀釋劑pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液無抑菌作用，對實驗無干擾，見表1。

2.6 細菌數、真菌數和酵母菌數測定方法的確定對乳核內消液按常規法、培養基稀釋法(每個平皿0.2 mL)、培養基稀釋法(每個平皿0.1 mL)、薄膜過濾法(每個平皿沖洗量300 mL)的順序進行實驗。在薄膜過濾法實驗中，另設稀釋劑對照組，取稀釋劑10 mL，薄膜過濾，用0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后一次沖洗液中加入實驗菌50～100 cfu，過濾，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂平板，置規定溫度培養48h觀察，測定稀釋劑對照組的回收率。用3批乳核內消液樣品進行驗證。見表2，3。

表1 稀釋劑回收實驗結果cfu

表2 消除供試品抑菌活性回收率 %

乳核內消液的微生物限度檢驗結果表明，真菌、酵母菌采用常規法其回收率均＞70%，采用薄膜過濾法(每個平皿沖洗量300 mL)，可確保細菌數的回收率均＞70%，符合《中華人民共和國藥典》的規定，方法可行。

表3 乳核內消液回收率實驗結果 %

2.7 控制菌大腸埃希菌檢驗方法的建立及驗證

2.7.1 菌液制備 菌液制備同“2.2”。

2.7.2 常規法 實驗組:取1∶10供試液10 mL接種至100 mL膽鹽乳糖培養基，同時加入大腸埃希菌50～100 cfu，35℃培養24～48 h。取培養物0.2 mL接種至含4-甲基傘形花內酯-β-D-葡萄糖苷酸培養基5 mL的試管中，35℃培養24 h，366 nm紫外燈下觀察熒光，然后進行靛基質實驗。另取培養物劃線接種于署紅亞甲藍平板，35℃培養18～24 h，觀察其菌落形態。陰性菌對照組:取金黃色葡萄球菌作為陰性對照實驗菌，方法同實驗組。

常規法實驗結果:經膽鹽乳糖培養基增菌培養后，實驗組有明顯產酸產氣現象，檢出大腸埃希菌，而陰性對照組未檢出大腸埃希菌。結果表明采用常規法進行大腸埃希菌檢驗，方法成立。見表4。

表4 大腸埃希菌檢查常規法實驗結果

3 討論

使用常規法對稀釋劑進行回收率實驗，結果5種實驗菌株的回收率均＞70%，表明稀釋劑pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液無抑菌作用，對實驗無干擾。薄膜過濾法另設的稀釋劑對照組，其3次獨立實驗稀釋劑對照組回收率(稀釋劑對照組平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率)均＞70%，同時，實驗組的菌數回收率均＞70%，證明采用薄膜過濾法(每個平皿沖洗量300 mL)可有效消除供試品的抑菌作用，并且證明該驗證實驗結果有效。

經方法驗證生產企業在原、輔料、生產和檢驗等條件不變的情況下，乳核內消液的微生物限度檢查方法:細菌計數方法為薄膜過濾法(每個平皿沖洗量300 mL)，真菌及酵母菌計數方法為常規法，控制菌大腸埃希菌檢查采用常規法。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄79.

［2］ 顏棟林，李萍，蘭茜.柴黃片微生物限度檢查法方法驗證［J］.中國當代醫藥，2009，16(16):7-8.

［3］ 張廣求.十九味赤芍膠囊微生物限度檢查方法的建立［J］.醫藥導報，2009，28(8):1075-1076.

［4］ 張麗梅，李俊，邢建華.抗生丸微生物限度檢查法的驗證［J］.醫藥導報，2009，28(6):792-793.