益腎健骨膠囊的質量標準研究

梁山丹，陳曉軍，粟華生，榮燕李，黃園，莫少紅

(廣西匯科藥物研究有限責任公司，南寧 530007)

益腎健骨膠囊系由千年健、制何首烏、丹參、淫羊藿、三七、人參、女貞子等藥味按規定方法制成，具有補益肝腎、益氣養血、化瘀通絡之功效，用于肝腎不足、氣虛血瘀所致的慢性腰腿痛，肢體疼痛，麻木［1］。原劑型質量標準鑒別方法［1-2］操作步驟繁瑣，生產檢驗周期長，筆者對其進行了修訂，并增加了丹參的薄層色譜鑒別。本品原劑型用高效液相色譜(HPLC)法測定齊墩果酸的含量［1，3］，齊墩果酸有抗炎、增強免疫、抑制血小板、降糖的作用，主要用于肝炎、高脂血癥等，本品中齊墩果酸含量較低，而淫羊藿苷具有促進免疫功能［4］、參與骨代謝［5］、補腎壯陽［6］等作用，與本品功能主治一致，故取消齊墩果酸的含量測定，選取淫羊藿苷作為含量測定指標成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津LC-2010A高效液相色譜儀，島津LCsolotion色譜工作站，島津UV-2450分光光度計。

1.2 試藥 大黃素對照品(批號:0756-9707)、甘草次酸對照品(批號:110723-200411)、淫羊藿苷對照品(批號:110737-200312)、人參皂苷 Rg1對照品(批號:110703-200322)、丹參對照藥材(批號:120923-200408)，均購于中國藥品生物制品檢定所;乙腈(色譜純)，流動相用水為自制雙蒸水，其他試劑均為分析純;益腎健骨膠囊及陰性對照樣品均由廣西博科藥業有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 大黃素、甘草次酸薄層色譜鑒別 取本品內容物7 g，加二氯甲烷 40 mL、鹽酸 4 mL，加熱回流 1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加1%氫氧化鈉溶液30 mL使溶解，用棉花濾過，濾液用二氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，棄去二氯甲烷提取液，水溶液用鹽酸調節pH至2～3，再用二氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，合并二氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺制何首烏、巴戟天陰性對照樣品，同法制成缺制何首烏、巴戟天的陰性對照溶液;取缺甘草陰性對照樣品，同法制成缺甘草陰性對照溶液。另取大黃素、甘草次酸對照品，分別加乙醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液各5～10μL，上述兩種對照品溶液各5μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(18∶2∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(波長254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與甘草次酸對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的暗斑。置紫外光燈(波長365 nm)及日光下檢視，供試品色譜中，在與大黃素對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點，置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，斑點變為紅色，陰性對照無干擾。見圖1。視;C.氨薰后，日光下檢視;1.缺甘草陰性樣品;2.甘草次酸對照品;3～5.益腎健骨膠囊;6.大黃素對照品;7.缺制何首烏、巴戟天陰性樣品

圖1 何首烏、巴戟天、甘草薄層色譜圖A.紫外光燈(254 nm)下檢視;B.紫外光燈(365 nm)下檢

2.2 丹參薄層色譜鑒別 取本品內容物10 g，加乙醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加1%硫酸溶液30 mL使溶解，用二氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，棄去二氯甲烷提取液，水溶液用水飽和的正丁醇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用5%碳酸鈉溶液提取2次，每次30 mL，正丁醇液留用，合并碳酸鈉液，用鹽酸調節pH至2～3，用乙酸乙酯提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺丹參陰性對照樣品，同法制成缺丹參陰性對照溶液。另取丹參對照藥材1 g，加乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1mL使溶解，作為對照藥材溶液。吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液各10μL、對照藥材溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(10∶2∶4∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的紅色主斑點，陰性對照無干擾。見圖2。

圖2 丹參薄層色譜圖1～3.益腎健骨膠囊;4.丹參對照藥材;5.缺丹參陰性樣品

2.3 淫羊藿苷薄層色譜鑒別 取“2.2”項下的正丁醇液，用水洗滌2次，每次30 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺淫羊藿陰性對照樣品，同法制成缺淫羊藿陰性對照溶液。另取淫羊藿苷對照品，加乙醇制成每毫升含0.25 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的黃色斑點，陰性對照無干擾。見圖3。

2.4 人參皂苷Rg1薄層色譜鑒別 取“2.3”項下的供試品溶液，加中性氧化鋁1 g，拌勻，蒸干，加于中性氧化鋁柱(內徑9 mm，干法裝柱)上，用40%甲醇溶液80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺人參、三七陰性對照樣品，同法制成缺人參、三七的陰性對照溶液。另取人參皂苷Rg1對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液各5～10μL、對照品溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點，陰性對照無干擾。見圖4。

圖3 淫羊藿薄層色譜圖1～3.益腎健骨膠囊;4.淫羊藿苷對照品;5.缺淫羊藿陰性樣品

圖4 人參、三七薄層色譜圖1～3.益腎健骨膠囊;4.人參皂苷Rg1對照品;5.缺人參、三七陰性樣品

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件與系統適用性實驗 色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(島津VP-ODS柱，150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(27∶73);流速:1.0 mL·min-1，柱溫:室溫;檢測波長 270 nm;進樣量:10μL。此條件下供試品色譜中淫羊藿苷與其他組分達到基線分離，分離度＞1.5，理論塔板數按淫羊藿苷峰計算＞6 000，淫羊藿苷保留時間約13 min，陰性無干擾。見圖5。

2.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成每毫升含50μg的溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液制備 取本品內容物，研細，取0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率260 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

圖5 3種樣品HPLC圖A.陰性樣品;B.淫羊藿苷對照組;C.益腎健骨膠囊樣品;1.淫羊藿苷

2.5.4 陰性樣品溶液的制備 取缺淫羊藿的陰性樣品1.0 g，同“2.5.3”項下方法制備，即得。

2.5.5 線性關系考察 精密量取1.041 mg·mL-1淫羊藿苷對照品溶液 0.1，0.3，0.5，1.0，1.5 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.010 41，0.031 23，0.052 05，0.104 10，0.156 15 mg·mL-1標準溶液。按上述色譜條件，分別進樣10μL，以峰面積(A)對淫羊藿苷進樣量(C，μg)進行回歸分析，得回歸方程:A=2 069 905C+6 401，r=0.999 9。表明淫羊藿苷進樣量在0.104 1～1.561 5μg范圍內與峰面積有良好線性關系。

2.5.6 精密度實驗 取52.05μg·mL-1淫羊藿苷對照品溶液，按上述色譜條件，重復進樣5次，測定峰面積。RSD為0.32%，儀器精密度良好。

2.5.7 穩定性實驗 取同一供試品溶液，分別在放置0，2，4，6，8，24，48，72 h 后進樣測定，其日內 RSD 為1.09%，日間RSD為1.29%，表明穩定性較好。

2.5.8 重復性實驗 取同一批號樣品，按“2.5.3”項下方法平行制備6份供試品溶液。按上述色譜條件測定，計算淫羊藿苷的含量為每粒0.706 mg，RSD為1.57%，表明方法重復性較好。

2.5.9 加樣回收率實驗 精密稱取已測知含量的樣品(批號:20070401)0.3 g，共6份，精密稱定，再分別精密加入1.041 mg·mL-1的淫羊藿苷對照品溶液0.5 mL，揮干溶劑，按“2.5.3”項下方法制備加樣回收供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算回收率，結果平均回收率98.76%，RSD=1.63%，見表1，表明方法回收率較好。

2.5.10 樣品測定 按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定3批樣品，以峰面積按外標一點法計算樣品中淫羊藿苷的含量，結果見表2。

表1 淫羊藿苷加樣回收率實驗結果

3 討論

在大黃素的薄層色譜鑒別研究中發現，原劑型方法“加二氯甲烷100 mL，超聲處理10 min”的處理可將部分大黃素提取出來而導致供試品色譜斑點減弱，本方法簡化了操作步驟，且同樣能同時鑒別大黃素、甘草次酸、齊墩果酸。本方法展開系統分離效果好，能同時鑒別兩種成分，故選用。

在丹參的薄層色譜鑒別中，試用了較多提取方法，結果供試品色譜中雜質均較多，分離效果不好，而本法雜質少，特征斑點清晰，且可與“2.3”項下供試品溶液一起提取。

在淫羊藿苷的薄層色譜鑒別中，對比了原劑型提取方法，結果供試品色譜中，雜質較多而本法淫羊藿苷特征斑點清晰，雜質較少，操作步驟較原劑型方法簡單。另試用了不同的展開系統:①三氯甲烷-甲醇-水(7∶3∶1)的下層溶液，展距9 cm，二次展開(為原劑型方法);②正丁醇-乙醇-甲酸-水(12∶2∶0.5∶2.5)，等。結果方法①分離效果不好，陰性有雜質斑點干擾;方法②比移值偏大，邊緣效應大，以正文收載系統分離效果較好，比移值適中。

在人參皂苷Rg1的薄層色譜鑒別中，原劑型提取方法供試品色譜斑點清晰，雜質少，但操作步驟繁瑣，而本法操作步驟較原劑型方法簡單，斑點清晰，雜質干擾少。展開系統選用《中華人民共和國藥典》鑒別人參皂苷Rg1方法［7］，操作較簡便，分離效果好，比移值適中。

實驗中參考文獻［8-11］對淫羊藿苷進行含量測定。另考察了供試品提取方法，淫羊藿苷為黃酮醇苷類化合物，易溶于甲醇、乙醇、水等溶劑，故考察提取溶劑甲醇及稀乙醇，結果以甲醇提取雜質少，峰形好。同時還考察了加熱回流時間(0.5，1.0，1.5 h)，超聲處理時間(15，30，60 min)，超聲處理30 min 即可提取完全。［DOI］ 10.3870/yydb.2011.06.039

［1］ 國家食品藥品監督管理局.國家中成藥標準匯編·骨傷科(第11分冊)［S］.2004:308-311.

［2］ 李忠瓊，張雯潔，馬昕，等.益腎健骨片的薄層色譜鑒別研究［J］.時珍國醫國藥，2004，15(9):591-592.

［3］ 李忠瓊，張雯潔，馬昕，等.高效液相色譜法測定益腎健骨片中齊墩果酸的含量［J］.時珍國醫國藥，2004，15(7):397-398.

［4］ LIU TH，WANG B X，WANG Y，et al.Effect of icariin and itsmetabolites on the production of cytokines by THP-lcells［J］.Acta Pharm Sinica，2000，35(4)，245-250.

［5］ 殷曉雪，陳仲強，黨耕町，等.淫羊藿苷對人成骨細胞增殖與分化的影響［J］.中國中藥雜志，2005，30(4):289-291.

［6］ 秦路平，石漢平，鄭水慶，等.蛇床子素和淫羊藿苷對甲甲狀腺功能減退小鼠血清甲狀腺激素的影響［J］.第二軍醫大學學報，1998，19(1):48-50.

［7］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.北京:化學工業出版社，2005:10.

［8］ 于洋，李倚云.補腎強身膠囊標準的研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2003，9(1):9-10.

［9］ 劉曉琳，顏曉航.高效液相色譜(HPLC)法測定抗骨增生顆粒中淫羊藿苷的含量［J］.現代中藥研究與實踐，2003，17(4):48-50.

［10］ 王波.舒心片質量標準的研究［J］.中藥材，2002，25(8):591-592.

［11］ 莫炫永.對藤黃健骨丸中淫羊藿苷的含量測定的研究［J］.中國中醫藥現代遠程教育，2007，5(5):38-40.