吡非尼酮對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的影響

李娣昕，曾紅兵，紀(jì)春陽(yáng)，梁萍萍，位紅蘭

(1.成都市第五人民醫(yī)院腎內(nèi)科，611130;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430030)

腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)是多種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同通路，是反映腎功能下降嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后最重要的指標(biāo)。因而，對(duì)其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制及其防治的研究有著重要的臨床意義。吡非尼酮(pirfenidone，PFD)是目前經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的少數(shù)可延緩甚至逆轉(zhuǎn)纖維化的藥物之一。實(shí)驗(yàn)證實(shí)［1-2］，PFD能夠延緩單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型大鼠TIF，但其機(jī)制尚未完全明了。筆者從腎小管上皮細(xì)胞(renal tublar epithelial cells，RTC)凋亡的角度初步探討 PFD對(duì)UUO模型大鼠TIF的作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與分組 雌性Wistar大鼠35只［由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證編號(hào):SCSK(鄂)2004-2007，體質(zhì)量 130 ～150 g］，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(7只)，模型組(14只)，治療組(14只)。模型組及治療組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組僅分離左側(cè)輸尿管，不結(jié)扎即關(guān)閉腹腔。各組大鼠均正常進(jìn)食、飲水，治療組從手術(shù)前1 d至手術(shù)后14 d給予PFD(上海睿星基因技術(shù)有限公司提供，純度 ＞99%，250 mg·kg-1·d-1，劑量參考文獻(xiàn)［3］，用1%羧甲基纖維素鈉溶液制成懸液)灌胃，其他組每日灌服等容積1%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.2 標(biāo)本留取 假手術(shù)組于手術(shù)后14 d處死;模型組和治療組于手術(shù)后7及14 d各處死一半大鼠。剖腹后先取下腔靜脈血(每只約5 mL)，用于生化檢測(cè)。各組均取左側(cè)腎臟皮質(zhì)組織，取約200 mg置于-80℃冰箱保存，其余置4%多聚甲醛中固定約36 h。常規(guī)制成切片厚約4μm。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 生化分析 下腔靜脈血經(jīng)1 500 r·min-1(r=10 cm)離心5 min后取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)，鉀離子(K+)和鈉離子(Na+)。

1.3.2 病理學(xué)檢測(cè)及纖維化評(píng)估 組織切片常規(guī)行過碘酸希夫染色(periodic acid-Schift stain，PAS)、Masson染色。應(yīng)用病理圖集采集和分析系統(tǒng)軟件(HMIA2000型)，在高倍鏡下每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)不含腎小球和大血管的腎皮質(zhì)視野，纖維化陽(yáng)性面積占統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積的百分比作為腎小管間質(zhì)的纖維化指數(shù)(%)，求和，取平均值。

1.3.3 腎小管上皮細(xì)胞凋亡及結(jié)果評(píng)估 應(yīng)用TUNEL堿性磷酸酶標(biāo)記的原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(德國(guó)羅氏)，按試劑盒說明進(jìn)行操作。不加酶的標(biāo)記溶液代替TUNEL反應(yīng)混合物作陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)室既往證實(shí)陽(yáng)性結(jié)果作為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞核呈棕黃色至黃褐色者為陽(yáng)性細(xì)胞，應(yīng)用病理圖集采集和分析系統(tǒng)軟件，在高倍鏡下對(duì)每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)互不重疊的皮質(zhì)視野(避開腎小球及大血管)，計(jì)數(shù)腎小管上皮細(xì)胞(根據(jù)凋亡細(xì)胞所處位置及該位置已知細(xì)胞組成來區(qū)分)，以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值作為凋亡指數(shù)(%)。

1.3.4 免疫組化測(cè)原位 半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白表達(dá)及腎小管上皮細(xì)胞陽(yáng)性評(píng)估試劑均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，按說明書進(jìn)行操作。磷酸鹽緩沖溶液代替一抗作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)室既往證實(shí)陽(yáng)性結(jié)果作為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞質(zhì)呈黃褐色、細(xì)胞核藍(lán)色或參雜少許黃褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果評(píng)估同上。

1.3.5 組織勻漿制作、比色法測(cè)丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)MDA、SOD、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。應(yīng)用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液裂解腎組織，制成10%和1%勻漿，比色法分別測(cè)定腎組織MDA含量及總SOD活性，按試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間的兩兩比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化分析 各組大鼠在BUN、Scr、K+和Na+指標(biāo)上無(wú)明顯差異。

2.2 病理學(xué)改變 假手術(shù)組腎臟病理改變不明顯;模型組可見不同程度腎小管擴(kuò)張或萎縮，間質(zhì)明顯趨向纖維化，以14 d時(shí)為重;治療組纖維化程度較模型組明顯減輕，詳細(xì)結(jié)果見表1。

2.3 腎小管上皮細(xì)胞凋亡改變 假手術(shù)組腎小管上皮細(xì)胞偶見凋亡;模型組則明顯增多，且凋亡指數(shù)隨病程延長(zhǎng)增加;治療組細(xì)胞凋亡明顯減輕，與模型組比較7及14 d分別減少53.0%，58.0%，詳細(xì)結(jié)果見表1。TUNEL染色14 d結(jié)果見圖1。陽(yáng)性細(xì)胞胞核呈黃色至褐色，細(xì)胞質(zhì)不著色。

表1 3組大鼠腎間質(zhì)纖維化、腎小管上皮細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)變化Tab．1 Ratio of TIF、apoptosis of RTCs and Caspase-3-positive RTCs of rats in 3 groups %±s

表1 3組大鼠腎間質(zhì)纖維化、腎小管上皮細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)變化Tab．1 Ratio of TIF、apoptosis of RTCs and Caspase-3-positive RTCs of rats in 3 groups %±s

與模型組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01;與假手術(shù)組比較，*3 P＜0.05Compared with model group，*1 P ＜ 0.05，*2 P ＜ 0.01;Compared with sham operation group，*3 P ＜0.05

組別與時(shí)間 大鼠/只纖維化指數(shù)凋亡指數(shù)Caspase-3-陽(yáng)性指數(shù)治療組14第7天 7.1±1.9*1 2.5±1.6*1 20.0±2.5*2第14天 16.2±2.0*1 3.8±2.4*1 25.0±3.5*2模型組 14第7天 10.5±2.7*3 5.3±2.0*3 30.0±2.5*3第14天 33.0±3.1*3 9.2±3.1*3 52.5±3.0*3假手術(shù)組7 2.3±0.4 0.4±0.2 8.7±2.0

2.4 腎小管上皮細(xì)胞Caspase-3表達(dá) 在假手術(shù)組，Caspase-3表達(dá)較少，模型組與之相比明顯增加，7及14 d分別增加2.4，5.0倍，而治療組分別下調(diào)33.0%，52.0%，詳細(xì)結(jié)果見表1。14 d染色結(jié)果見圖2。陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈黃色至褐色，細(xì)胞核可呈部分黃色至黃褐色。

圖1 3組大鼠高倍鏡下TUNEL陽(yáng)性的腎小管上皮細(xì)胞(×400)①假手術(shù)組;②模型組第14天;③治療組第14天Fig．1 TUNEL-positive RTCs of rats in 3 groups under high power lens(×400)①sham operation group;②UUO model group at day 14;③treatment group at day 14

圖2 3組大鼠高倍鏡下Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)的腎小管上皮細(xì)胞(×200)①假手術(shù)組;②模型組;③治療組Fig．2 Caspase-3-positive RTCs of rats in 3 groups under high power lens(×200)①sham operation group;②UUOmodel group;③treatment group

2.5 腎皮質(zhì)MDA含量及SOD活性 與假手術(shù)組比較，模型組MDA含量明顯升高，7及14 d時(shí)分別升高2.9，0.9倍(P＜0.01);與模型組同期相比，治療組MDA含量7 d時(shí)明顯下調(diào)(P＜0.01)，但14 d時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

與假手術(shù)組比較，模型組SOD活性降低，7及14 d分別降低46.0%，53.0%(P＜0.01);但治療組較模型組同期明顯上調(diào)，7及14 d分別上調(diào)33.0%，38.5%(P ＜0.01)。見圖3，4。

3 討論

TIF是各種腎臟病進(jìn)展至終末期的共同通路，也是判斷預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)，延緩TIF的進(jìn)展是治療腎臟疾病、改善預(yù)后有效方法。UUO模型是研究TIF的理想模型，故本實(shí)驗(yàn)選擇UUO大鼠作為研究對(duì)象。

PFD是一種新型的廣譜抗纖維化藥，能夠防止甚止逆轉(zhuǎn)纖維化的發(fā)生和瘢痕形成，它耐受性好，不良反應(yīng)少見而輕微，這已經(jīng)在大量的體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)［1］，可望成為腎纖維化治療的新選擇［2，4］，但機(jī)制了解甚少。

TIF是一個(gè)多因子多通路共同作用的復(fù)雜過程，總體來說，包括正常結(jié)構(gòu)的破壞和異常物質(zhì)的沉積。腎小管上皮細(xì)胞占腎單位的約80%。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其凋亡在TIF過程中起著重要的作用，它直接參與病理狀態(tài)下的腎小管萎縮、管腔擴(kuò)張等變化［5］，并可通過分泌白細(xì)胞介素、趨化因子等后效應(yīng)［6-7］，作用于其他細(xì)胞，參與細(xì)胞外基質(zhì)增多過程。故認(rèn)為能夠抑制TIF凋亡的藥物就極可能延緩或逆轉(zhuǎn)腎小管間質(zhì)纖維化，從而改善腎病患者腎功能及預(yù)后［8］。因此，筆者從RTC凋亡的角度，探討PFD對(duì)UUO模型TIF的影響。結(jié)果顯示UUO模型組與假手術(shù)組相比，腎小管上皮細(xì)胞凋亡顯著增多，尤其在腎小管擴(kuò)張或萎縮、細(xì)胞外基質(zhì)增多的部位，證實(shí)RTC凋亡在TIF中的作用;而治療組與模型組相比，RTC凋亡明顯減少，證實(shí)PFD對(duì)UUO模型中的RTC凋亡亦有抑制作用。故推斷PFD能通過抑制RTC的凋亡從而改善UUO的TIF。

對(duì)于PFD抑制凋亡的詳細(xì)機(jī)制，可從Caspase-3和氧化應(yīng)激兩方面進(jìn)行探討。一方面，Caspase是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的主要酶類，具有蛋白酶的生物學(xué)特性，其中Caspase-3參與凋亡過程的終末期，在凋亡病理過程中起著中心作用，對(duì)UUO所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡同樣起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)顯示在凋亡增多的小管，Caspase-3表達(dá)亦呈同樣趨勢(shì)增加，尤其在UUO模型組十分明顯;而在治療組，Caspase-3與RTC凋亡呈同樣趨勢(shì)下降。這不僅證實(shí)Caspase-3對(duì)RTC凋亡起著重要作用，亦說明PFD能通過抑制Caspase-3的表達(dá)從而抑制RTC的凋亡。

另一方面，UUO模型中由于手術(shù)張力應(yīng)激所致的腎血漿流量的下降(腎組織缺血、低氧)，巨噬細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞活化引起炎癥反應(yīng)等，均能產(chǎn)生大量的反應(yīng)氧代謝產(chǎn)物(reactive oxygen species，ROS)，而活性氧增多是凋亡的線粒體途徑的誘因之一，提示UUO手術(shù)后氧化應(yīng)激增強(qiáng)與腎組織細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，CUTTLE等［9］的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。許多學(xué)者也證實(shí)抗氧化劑 具有抗凋亡作用［10-12］。本實(shí)驗(yàn)顯示，UUO模型組腎皮質(zhì)勻漿中脂質(zhì)過氧化物的標(biāo)志物MDA明顯升高，提示在UUO手術(shù)后有大量的ROS產(chǎn)生;而機(jī)體最主要的抗氧化酶SOD的活性在UUO手術(shù)后明顯減少，這說明ROS的激增與機(jī)體對(duì)ROS的中和及清除減少有關(guān)。而在治療組，這兩方面均得到明顯改善。提示PFD能夠顯著改善氧化應(yīng)激，從而抑制RTC凋亡。

此外，各組大鼠的生化檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在2周內(nèi)UUO模型大鼠的腎功能仍處于代償，且提示PFD未造成額外的生物學(xué)不良反應(yīng)。

綜上所述，PFD能夠抑制UUO所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，從而延緩腎間質(zhì)纖維化，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激所致凋亡及Caspase-3相關(guān)的途徑有關(guān)。本研究為PFD治療UUO腎間質(zhì)纖維化提供了另外一條依據(jù)。

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