普羅布考對(duì)高同型半胱氨酸血癥兔腫瘤壞死因子-α和動(dòng)脈粥樣硬化的影響

吳樂，黎紅華，武強(qiáng)，王曉昆

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院1.神經(jīng)內(nèi)科;2.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 430070)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)從起源到最終并發(fā)癥的形成都是動(dòng)脈壁的慢性炎癥過程［1］。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是一種具有廣泛促炎活性的細(xì)胞因子，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程中發(fā)揮重要作用［2-3］。近年來研究表明，同型半胱氨酸(homocysteinemia，Hcy)是導(dǎo)致 AS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［4-6］。普羅布考已作為降血脂藥物應(yīng)用于臨床，同時(shí)也具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［7-8］。筆者以高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)兔高Hcy血癥及AS模型，探討普羅布考對(duì)高Hcy血癥致AS過程中的作用以及對(duì)TNF-α的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物 雄性純種新西蘭大耳白兔24只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購自湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(鄂)2008-0005。普羅布考粉劑購自山東齊魯制藥有限公司。

1.2 主要試劑 TNF-α引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，TNF-α的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒為R＆D公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將大耳白兔隨機(jī)分為3組，每組8只:對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料每只200 g·d-1;模型組喂高蛋氨酸飼料每只200 g·d-1(基礎(chǔ)飼料中加入1%蛋氨酸);治療組在喂高蛋氨酸飼料每只200 g·d-1基礎(chǔ)上，從第12周開始灌胃給予普羅布考每只1 g·d-1，共20周。

1.4 血清TNF-α及血漿Hcy測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每只動(dòng)物采血4 mL，其中2 mL不抗凝，3 000 r·min-1(r=5.5 cm)離心15 min，取上清液，用酶聯(lián)免疫法批量檢測(cè)血清TNF-α，嚴(yán)格按照試劑盒的程序操作。用依地酸二鈉溶液2 mL抗凝，30 min內(nèi)4℃ 3 000 r·min-1離心15 min，分離血漿，-80℃凍存，以高效液相色譜法檢測(cè)血漿Hcy。

1.5 病理形態(tài)學(xué)觀察 末次給藥后24 h禁食，不禁水，用氣栓法處死動(dòng)物，快速打開腹腔剝離腹主動(dòng)脈，剪取腹主動(dòng)脈約0.5 cm，10%中性甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片4μm，蘇木精-伊紅染色后于光鏡下觀察。其余腹主動(dòng)脈-80℃凍存。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈法檢測(cè)腹主動(dòng)脈中TNF-α的mRNA表達(dá)水平 按照Trizol說明書方法提取組織總RNA，測(cè)定總RNA濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng):在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系25μL中，以總RNA 4μg為模板，用Mix逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列 如 下:TNF-α :5 ＇-AGCTCCAGTGGCTGAACCG-3 ＇(上游，5＇-CAGGGCAATGATCCCAAAGTA-3＇(下游)，擴(kuò)增 片 段 為 398 bp;GAPDH:5＇-ACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAG-3 ＇(上 游)，5 ＇-TTC-AAGGGGTCTACATGGCAACTG-3＇(下游)，擴(kuò)增片段為 123 bp。反應(yīng)參數(shù)為:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，61℃退火45 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.6%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，治療前后比較采用配對(duì)資料t檢驗(yàn)，組間比較采用成組設(shè)計(jì)資料t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清TNF-α及血漿同型半胱氨酸水平 見表1。模型組血清TNF-α和血漿Hcy水平較正常組明顯增高。治療組較模型組血清TNF-α水平明顯下降。治療組和模型組血漿同型半胱氨酸水平檢查結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 3組兔TNF-α及Hcy水平的變化Tab．1 The changes of the levels of TNF-α and Hcy in the three groups of rats ±s

表1 3組兔TNF-α及Hcy水平的變化Tab．1 The changes of the levels of TNF-α and Hcy in the three groups of rats ±s

與模型組比較，*1 P＜0.05，*2 P＞0.05;與正常組比較，*3 P＜0.05Compared with the model group，*1 P ＜ 0.05，*2 P ＞ 0.05;Compared with the normal group，*3 P ＜0.05

組別 兔/只TNF-α/(pg·mL-1)Hcy/(μmol·L-1)治療組 8 4.01±1.13*1 43.42±3.53*2模型組 8 7.65±1.73*3 45.81±4.03*3正常組8 2.37±0.86 14.94±2.12

2.2 腹主動(dòng)脈TNF-α的mRNA表達(dá)水平 以正常組DNA擴(kuò)增條帶吸光度為對(duì)照，各組DNA擴(kuò)增條帶吸光度與之進(jìn)行比較，以所得比值作為TNF-α的mRNA水平的相對(duì)定量指標(biāo)。結(jié)果模型組腹主動(dòng)脈TNF-α的mRNA表達(dá)水平較正常明顯增高(P＜0.01)。治療組腹主動(dòng)脈TNF-α的mRNA表達(dá)明顯降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

2.3 組織形態(tài)學(xué)變化 見圖2。蘇木精-伊紅染色顯示，正常組血管壁內(nèi)膜光滑完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則;模型組血管內(nèi)膜明顯增厚，并可見一處內(nèi)膜下出血(箭頭處)，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂;治療組血管內(nèi)膜增厚明顯減輕，中膜平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則。

圖1 3組兔腹主動(dòng)脈TNF-α的mRNA表達(dá)與正常組比較，*1 P＜0.01;與模型組比較，*2 P＜0.05Fig．1 The m RNA expressions of TNF-α of abdom inal aorta in the three groups of ratsCompared with the normal group，*1 P ＜0.01;Compared with themodel group，*2 P ＜0.05

3 討論

研究證實(shí)，血漿Hcy水平升高是心血管疾病的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。健康人的血漿Hcy水平為5～10μmol·L-1。血漿Hcy水平嚴(yán)重升高的患者通常伴有早發(fā)性的動(dòng)脈粥樣硬化。迄今為止，血漿Hcy水平升高引起心血管疾病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。目前認(rèn)為主要與以下幾個(gè)方面有關(guān):①高Hcy導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙。如內(nèi)皮細(xì)胞合成一氧化氮減少，超氧陰離子產(chǎn)生增多，直接導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損害。由于代謝反應(yīng)，Hcy之間的自身氧化增強(qiáng)，導(dǎo)致活性氧、羥自由基和脂質(zhì)過氧化物激活劑增多，損傷血管內(nèi)皮［9-10］。②高Hcy促進(jìn)脂蛋白的氧化。當(dāng)血漿中Hcy水平增高時(shí)，Hcy間的自身氧化增強(qiáng)，活性氧產(chǎn)生增多，促使脂蛋白發(fā)生過氧化，導(dǎo)致低密度脂蛋白的氧化，生成氧化低密度脂蛋白［11］，從而易被巨噬細(xì)胞吞噬，巨噬細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞，導(dǎo)致脂質(zhì)條紋病變的產(chǎn)生和纖維斑塊的形成，促進(jìn)主動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。③高Hcy能引起許多炎癥遞質(zhì)釋放，引起單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，白細(xì)胞在粥樣斑塊中的聚集，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的形成［12］。④其他機(jī)制，如刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖和激活血栓形成。本研究觀察到給予20周高蛋氨酸飲食后，兔血漿Hcy水平明顯升高，同時(shí)主動(dòng)脈組織形態(tài)明顯改變，血管內(nèi)膜明顯增厚，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，可見高Hcy水平可以導(dǎo)致血管病變。

圖2 3組腹主動(dòng)脈蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×200)Fig．2 HE stain of abdom inal aorta in the three groups of rats(×200)

TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞也能產(chǎn)生TNF-α。TNF-α由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌后，通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖、影響脂類攝取與代謝、使血脂水平增高及增加細(xì)胞間質(zhì)膠原的合成等途徑參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成［13］。研究表明，人動(dòng)脈粥樣硬化病變處TNF-α表達(dá)增加［14］。血清TNF-α水平升高能加重動(dòng)脈粥樣硬化病變程度以及增加冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［15-16］。因此，降低血清TNF-α水平可能是防治動(dòng)脈粥樣硬化有效途徑。

普羅布考除了具有降血脂的作用外，還具有強(qiáng)大的抗氧化作用。普羅布考分子內(nèi)所含的酚羥基很容易被氧化而發(fā)生斷鏈，捕捉氧離子并與之結(jié)合形成穩(wěn)定的酚氧基，有效降低氧自由基濃度，從而預(yù)防或延遲動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，普羅布考可以通過其較強(qiáng)的抗氧化作用抑制該炎癥的發(fā)展［17-18］。普羅布考的脂溶性使其易于穿過內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)血管壁及脂質(zhì)斑塊之間發(fā)生抗氧化作用，從而抑制了斑塊的形成，改變斑塊的成分而發(fā)揮強(qiáng)大的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［19］。

本研究顯示，給予普羅布考治療8周后，兔血清TNF-α水平明顯下降，腹主動(dòng)脈TNF-α的mRNA表達(dá)明顯減少，兔主動(dòng)脈組織形態(tài)明顯改善，但血漿Hcy水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，普羅布考抗AS的作用可能與其能降低血清TNF-α以及抑制腹主動(dòng)脈TNF-α的mRNA表達(dá)有關(guān)。

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