鹽酸小檗堿與8-羥基二氫小檗堿對(duì)大鼠腦組織與血清中乙酰膽堿酯酶活性的影響*

王開(kāi)富，徐麗君，鄒欣，陸付耳

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，武漢 430030)

黃連用于治療消渴(相當(dāng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的糖尿病)有近2 000 a的歷史，從黃連提取出鹽酸小檗堿有約70 a的歷史，在20世紀(jì)80年代即有大量的臨床、實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)小檗堿具有確切的降血糖作用［1-2］。其后，人們對(duì)小檗堿抗糖尿病的作用機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究［3］。筆者觀(guān)察了鹽酸小檗堿和8-羥基二氫小檗堿對(duì)大鼠血清和腦勻漿中乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase，AChE)的抑制作用，比較鹽酸小檗堿和8-羥基二氫小檗堿治療糖尿病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 AChE測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，雙縮脲總蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);鹽酸小糪堿、8-羥基二氫小檗堿均溶于無(wú)水乙醇，并用無(wú)水乙醇稀釋成所需濃度，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所提供。

1.2 AChE樣本的制備 SD大鼠，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(鄂)2004-0007，體質(zhì)量(200±20)g。腹主動(dòng)脈取血5 mL后斷頭處死，冰臺(tái)快速取大腦，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰凍的磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液漂洗，用干凈的濾紙吸去大腦組織表面的水分和血液，稱(chēng)質(zhì)量)，用眼科剪盡快剪碎組織塊。將剪碎的組織倒入玻璃勻漿器中，再用少許冰凍磷酸鹽緩沖液沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿器中進(jìn)行冰浴勻漿。然后再加入冰凍的磷酸鹽緩沖液，按腦組織質(zhì)量與勻漿總體積1∶10的比例，稀釋混勻。將制備好的10%腦勻漿以3 000 r·min-1離心15 min(2-16K臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)制造)，取上清液待測(cè)。取出的血以1 000 r·min-1離心8min，取血清。檢測(cè)時(shí)將血清用磷酸鹽緩沖液按1∶9稀釋。

1.3 總蛋白含量的測(cè)定 用雙縮脲法測(cè)得大鼠腦組織勻漿總蛋白量為3.18 g。

1.4 大鼠血清與腦勻漿AChE活力測(cè)定 用改良Ellman比色法測(cè)定 AChE活力，按AChE測(cè)定試劑盒方法測(cè)定。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管組、不加藥測(cè)定管組、受試化合物(加鹽酸小檗堿或8-羥基二氫小檗堿)測(cè)定管組，每組均設(shè)空白對(duì)照管和測(cè)定管，大鼠腦組織勻漿液和血清取樣量為每管30μL。反應(yīng)體系混勻，37℃準(zhǔn)確反應(yīng)6 min，然后終止反應(yīng)，混勻放置 15 min，在波長(zhǎng)412 nm測(cè)定各管吸光度A(用磷酸鹽緩沖液調(diào)零)。受試藥鹽酸小檗堿、8-羥基二氫小檗堿分別配制成0.007，0.015，0.030，0.062，0.125，0.250，0.500，1.000 mg·mL-1。按下列公式測(cè)得鹽酸小糪堿、8-羥基二氫小檗堿對(duì)AChE的抑制率。

腦勻漿中 AChE活力 (U·mg-1)=(A測(cè)定管-A對(duì)照管)/(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) × 標(biāo)準(zhǔn)管濃度(1 μmol·mL-1)/蛋白量(mg·mL-1)。

每毫克組織蛋白樣本在37℃保溫6 min，水解反應(yīng)體系中1μmol基質(zhì)為1個(gè)活力單位 (U)。

血清中 AChE活力 (U·mL-1)=(A測(cè)定管-A對(duì)照管)/(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)× 標(biāo)準(zhǔn)管濃度 (1 μmol·mL-1)×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

每毫升血清樣本在37℃保溫6 min，水解反應(yīng)體系中1μmol基質(zhì)為1個(gè)活力單位(U)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

鹽酸小檗堿、8-羥基二氫小檗堿對(duì)大鼠腦組織和血清AChE活性均有明顯的抑制作用，抑制程度與鹽酸小檗堿和8-羥基二氫小檗堿的濃度具有明顯的量效關(guān)系，見(jiàn)表 1，2。

3 討論

已經(jīng)闡明2型糖尿病發(fā)病的兩個(gè)最根本的環(huán)節(jié)是胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗。然而，AChE活性增高也是2型糖尿病的病理現(xiàn)象之一。研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者血清AChE活性顯著高于正常人群;2型糖尿病大鼠血清和腦組織AChE活性顯著高于對(duì)照組，提示糖尿病病程中某些組織器官伴有AChE活性異常增高，那么AChE活性升高與血糖控制有何關(guān)聯(lián)?將膽堿酯酶抑制藥(溴化新斯的明)給糖尿病家兔肌內(nèi)注射后，發(fā)現(xiàn)家兔血清胰島素水平明顯升高，血糖下降，糖化血紅蛋白降低，表明2型糖尿病與AChE之間存在密切的關(guān)系［4-5］。

NAKANO等［6］報(bào)道，激活膽堿能受體或增加乙酰膽堿可以促進(jìn)β細(xì)胞鈣離子(Ca2+)內(nèi)流引起三磷腺苷依賴(lài)性鉀通道關(guān)閉而促進(jìn)胰島素顆粒釋放和分泌。然而，AChE能專(zhuān)一性地水解乙酰膽堿成膽堿和乙酸。盡管還不清楚為什么2型糖尿病患者AChE活性增高，但可以肯定AChE活性升高勢(shì)必加速對(duì)乙酰膽堿的破壞而導(dǎo)致乙酰膽堿減少，從而影響胰島素分泌，這可能是血糖調(diào)節(jié)障礙的重要原因之一。

表1 不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)大鼠腦組織和血清中AChE的抑制作用Tab．1 The inhibitory effect of berberine hydrochloride of different cencentration on AChE activity in the cerebral tissue and serum of rats ± s，n=10

表1 不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)大鼠腦組織和血清中AChE的抑制作用Tab．1 The inhibitory effect of berberine hydrochloride of different cencentration on AChE activity in the cerebral tissue and serum of rats ± s，n=10

與不含鹽酸小檗堿組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05Compared with the group without berberine hydrochloride，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05

鹽酸小檗堿濃度/(mg·mL-1)大鼠/只腦組織AChE活力/(U·mg-1)AChE抑制率/%血清AChE活力/(U·mL-1)AChE抑制率/%0.007 10 0.998±0.126*1 52.57 5.541±2.004 8.44 0.015 10 0.980±0.113*1 53.42 4.533±1.102*2 25.10 0.030 10 0.914±0.164*1 56.56 3.468±0.906*1 42.70 0.062 10 0.852±0.137*1 59.51 2.512±0.675*1 58.49 0.125 10 0.812±0.124*1 61.41 1.523±0.326*1 74.83 0.250 10 0.672±0.108*1 68.06 0.986±0.284*1 83.71 0.500 10 0.421±0.096*1 79.99 0.730±0.057*1 87.94 1.000 10 0.374±0.067*1 82.22 0.025±0.007*1 99.59 0.000 10 2.104±0.272 … 6.052±2.384…

表2 不同濃度8-羥基二氫小檗堿對(duì)大鼠腦組織和血清中AChE的抑制作用Tab．2 The inhibitory effect of8-hydroxy dihydroberberine of different cencentration on AChE activity in the cerebral tissue and serum of rats ± s，n=10

表2 不同濃度8-羥基二氫小檗堿對(duì)大鼠腦組織和血清中AChE的抑制作用Tab．2 The inhibitory effect of8-hydroxy dihydroberberine of different cencentration on AChE activity in the cerebral tissue and serum of rats ± s，n=10

與不含8-羥基二氫小檗堿組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with the group without8-hydroxy dihydroberberine，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

8-羥基二氫小檗堿濃度/(mg·mL-1)大鼠/只腦組織AChE活力/(U·mg-1)AChE抑制率/%血清AChE酶活力/(U·mL-1)AChE抑制率/%0.007 10 1.708±0.247*1 32.78 6.220±1.389 11.72 0.015 10 0.906±0.156*2 64.34 5.706±1.675*1 19.02 0.030 10 0.987±0.143*2 61.16 4.925±1.003*2 30.10 0.062 10 0.906±0.128*2 64.43 3.522±0.989*2 50.01 0.125 10 0.826±0.097*2 67.49 2.497±0.894*2 64.56 0.250 10 0.303±0.084*2 88.08 1.511±0.643*2 78.56 0.500 10 0.223±0.065*2 91.22 0.322±0.068*2 95.43 1.000 10 0.098±0.003*2 96.14 0.029±0.004*2 99.59 0.000 10 2.541±0.383 … 7.046±2.574…

本研究結(jié)果表明，鹽酸小檗堿和8-羥基二氫小檗堿對(duì)大鼠腦組織和血清中AChE活性均有明顯的抑制作用，且抑制程度與鹽酸小檗堿和8-羥基二氫小檗堿的濃度具有明顯的量效關(guān)系;另有研究表明:黃連中含

有5種分子結(jié)構(gòu)十分相似的物質(zhì)，即小檗堿、藥根堿、巴馬汀堿、表小檗堿和黃連堿。這5種生物堿中只有小檗堿和藥根堿具有降糖作用，且小檗堿降糖效果強(qiáng)于藥根堿［7］，抑制AChE活性可能是小檗堿發(fā)揮降糖功效的作用機(jī)制。

盡管小檗堿臨床應(yīng)用多年，但由于小檗堿降糖的作用機(jī)制迄今尚不完全清楚，加上小檗堿吸收差、生物利用度低等特點(diǎn)可能導(dǎo)致其在降糖作用強(qiáng)度上比較溫和，因而目前尚未能在臨床廣泛地用于治療2型糖尿病。為了增加小檗堿的吸收，筆者將其改造為8-羥基二氫小檗堿。本實(shí)驗(yàn)證明，改造后的小檗堿對(duì)AChE活性也具有明顯的抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8-羥基二氫小檗堿與鹽酸小檗堿對(duì)大鼠AChE的抑制作用雖沒(méi)有明顯差異，但改造后的小檗堿增加了生物利用度，只需口服較小劑量，就能發(fā)揮對(duì)AChE的抑制作用。小檗堿的分子結(jié)構(gòu)明確，如果上述推測(cè)得以證實(shí)就可以確定AChE為小檗堿作用的新靶點(diǎn)，這對(duì)中藥單體的研究將是一大突破，不僅可以科學(xué)闡明小檗堿治療糖尿病的機(jī)制而促進(jìn)其臨床應(yīng)用，而且還可以針對(duì)其吸收差、生物利用度低等特點(diǎn)運(yùn)用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在小檗堿系列衍生物中篩選出吸收更好、效應(yīng)更強(qiáng)的降糖單體，這些有待進(jìn)一步研究。

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