離子注入水稻細胞學效應研究

代西梅, 張佳佳， 楊 旭， 黃群策

(鄭州大學 河南省離子束生物工程重點實驗室 河南 鄭州 450052)

離子注入水稻細胞學效應研究

代西梅, 張佳佳， 楊 旭， 黃群策

(鄭州大學 河南省離子束生物工程重點實驗室 河南 鄭州 450052)

以水稻品種紫粳二倍體和四倍體為實驗材料，以低能氮離子束為誘變源，研究了離子束誘變對水稻根尖細胞染色體的影響.結果發現，低能離子束注入引起了水稻根尖分生區細胞有絲分裂異常，出現許多染色體畸變類型，包括后期染色體橋、落后染色體、染色體斷片、中期染色體單價體等.染色體畸變率并不是隨著劑量的增加呈現直線上升的趨勢，而是有一定的擺動性，但總體趨勢是注入劑量越大，畸變率越高.由此可見，離子注入引起水稻染色體異常是其發生遺傳性變異的細胞學基礎.

水稻； 離子束注入； 有絲分裂； 誘變； 染色體

0 引言

20世紀80年代中期發展起來的離子束生物技術[1]，具有獨特的技術原理和簡單的操作程序，在作物育種中其實用性已經被越來越多的研究結果所證實[2-3].它具有質量、能量、電荷三位一體的功效，損傷輕，誘變率高，誘變譜寬[4],在誘變育種中取得了不少成果[5-6].但其基礎理論研究仍很薄弱，尤其是從染色體以及蛋白質分子水平開展的研究甚少[7-8].同時低能重離子與生物物質的相互作用不但涉及能量沉積，而且還包含質量沉積及動量傳遞、電荷交換等物理過程，因而其作用機理比γ射線復雜得多，致使生物體誘變的作用機制仍未有統一的、合理的、明確的解釋.

水稻是世界上重要的糧食作物之一，對其遺傳學和細胞學的研究已有上百年的歷史.作者通過對離子束注入處理的水稻與其對照進行細胞學及染色體形態的研究，探討了離子注入對水稻誘變的特點，并利用離子注入技術提高水稻的突變率，篩選變異材料，用于水稻遺傳育種研究.

1 材料與方法

1.1實驗材料

水稻品種紫粳二倍體及四倍體材料，由鄭州大學離子束生物工程重點實驗室提供.

1.2離子注入方法

挑選籽粒飽滿的水稻成熟種子脫殼，種子胚朝上置于同一個鋪有花泥的培養皿中，將其置入從俄羅斯進口的Titan脈沖式離子注入機的靶室中進行氮離子注入.注入劑量分別為4×1017，6×1017，8×1017N+/cm2.每劑量每次處理成熟干種子500粒，重復3次.在靶室中氮離子源的注入能量25 keV，注入時的真空度5×10-2Pa，采用脈沖式注入，束流200 mA.未注入的同一批紫粳材料作為對照.

1.3根尖分生區細胞有絲分裂染色體行為觀察

材料準備：將種子浸泡24 h后，放置在鋪有濕潤濾紙的培養皿中，25 ℃暗培養，生根.

固定：幼根長1～2 cm時，上午9：00～11：00用卡諾固定液(V(酒精)∶V(醋酸)=3∶1)固定2～24 h，70%酒精清洗后放入70%酒精中4 ℃保存備用(保存時間一般不超過1 w).

解離：將固定好的材料放入解離液(V(無水乙醇)∶V(37%的濃鹽酸)=1∶1)中，室溫下解離5～10 min.

染色：用蒸餾水清洗數次,徹底洗去解離液，根尖放在解剖鏡下找出分生區(一個解離良好的材料，分生區在解剖鏡下是不透明的，而成熟區和根冠部分則是透明的)，在解剖鏡下用刀片把分生區切為2～3部分，使細胞更易著色.然后在載玻片上滴上卡寶品紅染色液[9]進行染色，染色時需要在酒精燈上微微加熱，染色時間10 min.

壓片：將蓋玻片的一側與染色液接觸，待染色液沿接觸面均勻擴散后，再緩慢放下蓋玻片，用吸水紙吸取多余的染色液.用拇指以適當的力度按壓.用鉛筆輕輕敲擊蓋片，使染色體充分分散.

將壓好的片子置于顯微鏡下觀察，找到良好的細胞分裂相各期細胞，對發生染色體異常行為的有絲分裂細胞進行分類統計并取相.每個處理至少觀察30個根尖，每個根尖取10個視野進行觀察統計.

2 結果與分析

2.1低能氮離子處理后水稻根尖細胞的有絲分裂過程觀察

有絲分裂是一個連續、動態的過程，一般分為5個時期，如圖1.在這5個時期中最明顯的特征就是染色體呈現出連續、動態的變化.在光學顯微鏡下，根據染色體的收縮程度、集結情況等特征來確定細胞所處的分裂時期.

圖1 水稻根尖細胞有絲分裂過程的顯微觀察Fig.1 Observe the mitotic process of the rice

離子注入引起染色體結構異常和細胞分裂中染色體的行為改變(圖2).結果表明，在離子注入后的根尖細胞中，出現了一些染色體或染色單體斷片(圖2b～d).在分裂后期不能正常向細胞的兩極移動，滯留在細胞成膜體附近，形成落后染色體(圖2a)；具有雙著絲粒的染色體，在分裂后期可能受到來自兩極的紡錘絲牽引，形成橋式結構(圖2e～f)，并隨著分裂的進行最終導致染色體斷裂，也有可能形成運動滯后的染色體.運動滯后的染色體或斷片在一定的時限內不能到達細胞的極點，末期核膜重建時不能包被到子核當中，成為細胞中的微核(圖2g).其中斷片形成細胞中體積較小的微核，滯后染色體形成細胞中另一類體積較大的微核.因為部分細胞中同時存在多種染色體異常，如多個斷片與滯后染色體同時存在，分裂末期可能因相距較遠不能包被到同一微核內，使細胞中出現多個微核.

圖2 離子注入材料有絲分裂染色體異常行為Fig.2 Chromosome aberrances in mitosis of cells implemented by ion beam

2.2不同劑量的氮離子注入對水稻根尖細胞染色體畸變率的影響

對離子注入處理的水稻根尖細胞有絲分裂進行觀察，發現不同水稻材料在不同劑量處理下均出現了染色體橋、染色體小斷片和落后染色體等畸變類型，但其畸變率均小于1%，如表1所示.在二倍體和對應的四倍體水稻的根尖細胞中染色體橋、染色體片段和落后染色體的畸變率并不是隨著劑量的增加呈現直線上升的趨勢，而是有一定的擺動性，但總體趨勢是注入劑量越大，畸變率越高.4×1017N+/cm2和6×1017N+/cm2劑量處理，水稻根尖細胞染色體畸變率差別不大，6×1017N+/cm2劑量處理下的染色體畸變率稍低于4×1017N+/cm2劑量處理下的染色體畸變率.而8×1017N+/cm2劑量處理下的染色體畸變率明顯提高.從表1中還可以看出，在相同劑量的處理下，紫粳四倍體水稻的畸變率稍高于二倍體水稻的畸變率.

表1 氮離子注入水稻根尖染色體畸變類型及畸變率

3 討論和結論

通過研究離子束注入對水稻根尖細胞及其染色體形態和結構的影響，探討了其在水稻誘變育種中的作用及機理.研究結果表明，經過離子束注入后的根尖細胞比對照材料發生染色體異常行為的概率更高.這與前人在銀杏[10]、甜菊[11]和小麥[12]中的研究結果一致.有絲分裂后期出現染色體運動滯后的原因，可能主要有以下幾個方面：染色體或染色單體斷片因沒有紡錘絲的牽引，在細胞分裂后期無法正常向細胞的兩極運動，滯留在細胞的中央板附近；離子注入處理導致紡錘絲不健全或缺失，使部分染色體不能有效向極移動；由染色體錯接形成的具有兩個著絲粒的復雜結構，分裂后期難以正常分離，產生向極運動的滯后現象.

染色體橋的出現可能是因為雙著絲粒染色體的兩個著絲粒分別受到來自細胞兩極的紡錘絲牽引，在兩組子染色體相互分離時出現橋式結構；或者是因為染色體末端相互黏連引起[13].

一般認為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片產生的.有實驗證明，整條染色體或幾條染色體也能形成微核.這些斷片或染色體在分裂過程中行動滯后，在分裂末期不能進入主核，便形成了主核之外的核塊.當子細胞進入下一次分裂間期時，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核.如多個斷片與滯后染色體同時存在，它們在分裂末期可能因相距較遠不能包被到同一微核內，可使細胞中出現多個微核[14].

離子束注入引起水稻根尖細胞染色體異常的可能原因是，離子束作為一種新的誘變源，通過質量沉積、能量沉積、電荷作用以及表面蝕刻作用對目標細胞以及細胞內的分子結構造成了不可逆的損傷，這種損傷的過程是通過離子束的物理作用轉變為分子上的化學改變，繼而影響到生物化學上的功能性改變，這種改變最后被生物體的新陳代謝放大為生物學上的現象.

由此可見，離子注入可以引起水稻染色體異常，這是誘變產生變異部分的原因，也可能是其發生可遺傳性變異的細胞學基礎.

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StudyonCytologicalEffectsofRiceImplantedwithIonBeam

DAI Xi-mei, ZHANG Jia-jia, YANG Xu, HUANG Qun-ce

(HenanProvincialKeyLaboratoryofIonBeamBio-engineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052，China)

The seeds of diploid and tetraploid rice were implanted by nitrogen ion beam.The cytological effects of the root tip cells were studied. The results showed that ion beam implantation could inhibit the survival rate and lots of types of chromosome aberration were observed in the mitosis of root tip cells of M0 generation,such as chromosome bridge,chromosome fragment,univalent and polyvalent. Chromosome aberration rate was not proportional to N+ion treatment dosages. But as a whole,the more of the dose,the higher of the chromosome aberration rate. The results proved that ion beam could cause abnormity of chromosomes,which might be the cytological reason that leading to the heritable mutations.

rice;ion beam implantation;mitosis;mutagenesis;chromosome

S 121

A

1671-6841(2011)04-0096-04

2011-03-09

河南省自然科學基金資助項目，編號2008A208019；農業部農業公益性行業科研專項經費資助項目，編號200803034.

代西梅(1974-)，女，副教授，博士，主要從事植物遺傳育種研究，E-mail:daiximei@yahoo.com.cn.