太行山獼猴種群mtDNA遺傳多樣性研究

謝東明, 路紀琪, 王建東

(1.鄭州大學 生物多樣性與生態學研究所 河南 鄭州 450001；2.太行山獼猴國家級自然保護區濟源管理局 河南 濟源 454650)

太行山獼猴種群mtDNA遺傳多樣性研究

謝東明1, 路紀琪1, 王建東2

(1.鄭州大學 生物多樣性與生態學研究所 河南 鄭州 450001；2.太行山獼猴國家級自然保護區濟源管理局 河南 濟源 454650)

2007年11月～2008年2月，利用非損傷性取樣法，在太行山獼猴國家級自然保護區采集到3個地理單元、5個野生種群獼猴個體的糞便樣品，并從22份樣品中提取到DNA，在此基礎上，分析和探討了野生太行山獼猴種群的遺傳多樣性狀況及種群遺傳結構.結果表明：①在341 bp的mtDNA控制區序列中發現11個變異位點，其中轉換和顛換的位點分別為9個和2個；②在3個地理單元中，共定義了9種單倍型；③AMOVA分析結果表明，88.02%和11.03%的遺傳變異分別發生在各地理單元間和各種群間，而地理單元內的各種群間的遺傳變異僅占0.95%，且濟源、焦作和新鄉3個地理單元間存在著顯著的遺傳分化(P<0.01),無共享單倍型；④濟源黃楝樹種群具有最多的單倍型數(3),最高的單倍型多樣性(0.833),最高的核苷酸多樣性(0.002 93)和最高的平均核苷酸差異數(1.000).因此，從保護物種基因多樣性的角度考慮，建議自然保護區管理部門將該種群列為優先保護單元.

獼猴(Macacamulatta)； 線粒體DNA； 遺傳多樣性； 太行山

0 引言

瀕危物種的種群遺傳多樣性研究對合理、科學地制定保護策略有十分重要的意義.但是，由于研究樣品(尤其是動物樣品)的采集困難，導致相關信息的獲得十分有限，從而制約種群遺傳多樣性研究的發展[1].這一困難隨著技術的不斷進步而得以解決.采用 mtDNA 多態性分析方法，可從分子層面了解群體的遺傳多樣性信息，還可結合宏觀生態學深入探討形成該物種獨特遺傳結構的地理、氣候和歷史原因[2].因此，mtDNA是一種非常實用的遺傳標記方法[3].

獼猴(Macacamulatta)，別名恒河猴、黃猴、廣西猴，隸屬于猴科(Cercopithecidae)獼猴屬，是國家二級重點保護野生動物.分布于太行山區的獼猴常被稱為太行山獼猴，為獼猴華北亞種(M.m.tcheliensis)，也是我國特有的一個獼猴亞種，其形態、生理、代謝、生態和遺傳等方面特征明顯，現有數量約2 500只.以往對太行山獼猴的生態學研究主要集中在地理分布、種群數量調查等方面[4-6]，有關其種群遺傳多樣性研究尚無系統報道.作者利用mtDNA的特點，從分子生態學角度探討生物多樣性的保護問題，可為查清太行山獼猴的遺傳背景、珍稀瀕危物種的保護提供基礎資料.

1 材料與方法

1.1樣品采集

太行山獼猴為國家重點保護野生動物，因此，樣品采集的原則是：1)以非損傷性取樣為主，即僅采集太行山獼猴的糞便樣品，盡量避免破壞性取樣；2)各個樣品應具有充分代表性，樣品應來自該地區的不同地理種群，并盡可能使采樣點散布于整個地區.為避免糞便樣品中動物DNA的降解，采集到的新鮮糞樣均用無水乙醇浸泡法并置冰箱-20 ℃保存.樣品采集信息見表1.

表1 太行山獼猴糞便樣品采集信息表

1.2方法

采用QIAGEN公司出品的糞便DNA提取試劑盒提取總DNA.PCR引物為GH：5′-AACTGGCATTCTATTTAAACTAC-3′；GL：5′-ATTGATTTCACGGAGGATGGT-3′.PCR反應體系(25 μL)：10×Buffer 2.5 μL；dNTPs(2.5 mmol/L)2.5 μL；Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL；BSA(10 mg/mL) 3 μL；Taq DNA酶(5 U/μL)(大連寶生物工程公司)0.5 μL；引物各1.25 μL；模板DNA 2.5 μL；純水10 μL.PCR反應條件：94 ℃預變性6 min，35個循環(94 ℃變性50 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s)，72 ℃再延伸6 min，4 ℃保存.PCR擴增產物利用試劑盒(大連寶生物工程公司)回收.回收產物委托北京諾賽基因組研究中心有限公司在全自動測序儀上完成單向測序反應.

1.3數據處理

用Clustal X[7]和MEGA 4.0[8]對測定序列進行比對.用DnaSP 4.5軟件包[9]計算所獲序列的單倍型多態性、核苷酸多態性及核苷酸差異均數和核甘酸歧異度.依據Nei的模型[10]，Hudson等[11]和Slatkin等[12]的計算方法，用Arlequin(version 3.0)軟件包[13]分別計算地理單元之間的遺傳分化系數(Gst)、遷移個體數(Nm)和遺傳變異在種群內及種群間的分布Fst值，并用排列測驗法檢驗Fst值的顯著性(重復次數為1 000)，同時利用該軟件包進行分子方差分析(AMOVA).以分布于中國廣西的獼猴指名亞種(M.m.mulatta)(GenBank：AF135287.1)為外群，用MEGA 4.0構建個體系統樹[8].

2 結果與分析

2.1變異位點的分析

用MEGA 4.0軟件分析mtDNA控制區片段序列變異位點后發現，在所分析的22個獼猴個體的序列中，共檢測到9種單倍型，11個變異位點，并且主要集中在序列的1～305個位點，分別位于第1，6，55，83，128，162，228，255，264，266和305位點(表2).11個變異位點中有9個位點是堿基轉換，2個位點是顛換.

2.2群體遺傳結構分析

不同地理種群中單倍型的分布見表3.在5個采樣地區的種群中，共發現9種單倍型，其中王屋山種群的5個個體中，有4個個體共享一種單倍型；黃楝樹種群的4個個體分屬于三種單倍型，其中兩個個體與王屋山種群的4個個體共享一種單倍型；五龍口種群的4個個體分屬于兩種單倍型；焦作沁陽種群的5個個體共享一種單倍型；新鄉輝縣種群的4個個體分屬于兩種單倍型，有3個個體共享一種單倍型.

表2 太行山獼猴D-loop片段9種單倍型的變異位點分布

表3 太行山獼猴9種單倍型在不同群體中的分布

2.3系統樹分析

通過MEGA 4.0軟件分析，并依據Kimma 2-Parameter模型，采用Bootstrap 1000檢驗分子系統樹各分支的置信度[8]，構建太行山獼猴總群體和5個地區種群間的UPGMA(unweighted pair group method of arithmetic means)分子系統樹(圖1，圖2).

Guangxi：廣西獼猴，作為外群

Wang：濟源王屋山；Huang：濟源黃楝樹；Wu：濟源五龍口；Jiao：焦作沁陽；Xin：新鄉輝縣

由圖1可見，各單倍型形成了以地理單元為特點的族群地理分布格局.由圖2可見，王屋山種群和黃楝樹種群聚在一起，五龍口種群和焦作沁陽種群聚在一起，新鄉輝縣種群獨立成一支.因此將王屋山和黃楝樹地區作為一個地理單元，命名為濟源單元；五龍口和沁陽地區作為一個單元，命名為焦作單元；新鄉輝縣為一個獨立單元，命名為新鄉單元.

表4 遺傳變異在地理單元中的分布

2.4分子遺傳變異分析

分子方差分析(AMOVA)結果表明(表4)，顯著差異主要存在于太行山獼猴不同的地理單元之間(ΦCT=0.880 21，P<0.001)和不同的種群之間(ΦST=0.889 71，P<0.00l).但是，同一地理單元內不同種群之間則不存在顯著性差異(ΦSC=0.079 26，P=0.107).

2.5不同群體之間的遺傳多樣性分析

利用DnaSP 4.5軟件，分別對5個地區的太行山獼猴種群遺傳多樣性參數進行計算分析(表5).結果表明，單倍型多樣性(H)，核苷酸多樣性(Pi)和平均核苷酸差異數(k)在濟源黃楝樹種群的數值明顯高于其他4個地區，分別為0.833，0.002 93和1.000.在上述分析的基礎上，對中性進化假說進行檢驗，發現太行山獼猴5個地區種群的Tajima的D值和Fu and Li的D值均不存在顯著性差異(P>0.1)，符合中性突變，表明這些地區的太行山獼猴具有非常穩定的種群結構[14].

表5 太行山獼猴mtDNA多樣性信息表(種群內)

2.6地理單元之間的遺傳多樣性

通過DnaSP 4.5分析軟件，分別對濟源(王屋山和黃楝樹)、焦作(五龍口和沁陽)和新鄉(輝縣)三個地理單元之間進行比較(表6).結果表明，焦作-新鄉地理單元間的核苷酸歧異度(Dxy=0.021 59)和平均核苷酸差異數(k=3.615 38)高于濟源-新鄉地理單元間的核苷酸歧異度(Dxy=0.019 31)和平均核苷酸差異數(k=3.461 54)及濟源-焦作地理單元間的核苷酸歧異度(Dxy=0.010 46)和平均核苷酸差異數(k=2.176 47).

由表6可知，太行山獼猴在濟源與焦作單元間的Fst值為0.828 72，兩單元間每代遷移個體數為0.05；濟源與新鄉單元間的Fst值為0.898 73，兩單元間每代遷移個體數為0.03；焦作與新鄉單元間的Fst值為0.939 62，兩單元間每代遷移個體數為0.02.濟源與焦作單元間的Gst值為0.735 74；濟源與新鄉單元間的Gst值為0.803 40；焦作與新鄉單元間的Gst值為0.893 72.可見三個地理單元間基因流和遺傳分化系數的差異值均較高，地理單元間的每代遷移個體數幾乎為零，表明太行山獼猴三個地理單元之間的遺傳分化程度較高，基本不存在有效的基因交流，尤以焦作和新鄉兩單元之間最為明顯.

表6 太行山獼猴mtDNA多樣性信息表(地理單元之間)

3 討論

3.1單倍型和群體的遺傳結構分化

對太行山獼猴mtDNA控制區序列的比對結果表明，22個個體樣品中存在9種單倍型.太行山獼猴群體的核苷酸多態性(0.010 64)低于川金絲猴群體(0.033)，大熊貓群體(0.06)[15]和白頭葉猴群體(0.011 67)[16]的核苷酸多態性.從所檢測的5個不同種群的單倍型多態性(H)和核苷酸多態性(Pi)來看，太行山獼猴不同地區的種群均存在高H值而低Pi值的特點(表5)，其群體的單倍型多態性(H)和核苷酸多態性(Pi)分別為0.827和0.010 64.這種高H、低Pi值的現象表明，整個太行山獼猴地理群體可能正在經歷一個較小種群迅速擴增的過程.此外，在22只太行山獼猴個體中檢出了9種單倍型，這一比例表明太行山獼猴不同個體間可能存在著廣泛的遺傳突變.在所得到的9種單倍型中，三個地理單元之間不存在相同的單倍型.但單倍型Wa2為濟源地理單元內的王屋山群和黃楝樹群所共享，即王屋山種群和黃楝樹種群之間分化不顯著.由此可知，太行山獼猴不同地理單元之間存在著明顯的分化，而同一地理單元內不同種群之間的分化程度則要低一些；分子方差分析結果也支持這一結論[13].

分子方差分析結果表明，太行山獼猴不同地理種群的遺傳差異主要由兩部分組成，即不同地理單元之間(88.02%)和不同種群之間的差異(11.03%)，占全部遺傳差異的99.05%(P<0.001)；而同一地理單元內不同種群間的遺傳差異僅占總遺傳差異的0.95%，且差異未達顯著性水平(P=0.107).產生上述顯著性差異的原因可能是獼猴棲息地之間的隔離，這種隔離使個體之間很難進行有效的基因交流從而產生明顯遺傳分化.但是，隨著人口增長和經濟的發展，人類與獼猴爭奪生存空間的矛盾越來越突出，如開礦、砍伐林木、開荒種地、修建各種基礎設施(鐵路、公路、水庫等)等活動給獼猴的棲息地環境造成了嚴重的破壞.棲息地的破碎化導致了不同地理單元之間缺乏有效的基因交流，從而產生了顯著的遺傳差異[17].

3.2分子系統地理學分析

從UPGMA法構建的聚類樹(圖2)可見，黃楝樹種群和王屋山種群聚為濟源地理單元，五龍口種群和沁陽種群聚為焦作單元，輝縣種群獨立成為新鄉單元.由此可知，自然環境加上人類頻繁活動的影響，導致獼猴棲息地的破碎化，逐漸發生隔離，最終形成相互獨立的地理單元.太行山獼猴9種單倍型的系統發育關系樹表明(圖1)，各單倍型在系統樹中并非雜亂分布，而是形成明顯的按照地理單元為特點的分布格局(地理族群).造成9種單倍型的分布格局以及三個地理單元種群之間存在顯著性遺傳差異的主要原因，并不是原始自然地理環境的變遷，而在于人類的頻繁活動、人類居住地的不斷擴張以及人類活動對自然地理環境的改變.另外，單倍型Wa2、Wa4、H2、H4首先與其他單倍型產生分化，組成了單獨的一支.濟源地理單元中的黃楝樹種群和王屋山種群共享一種單倍型，且單倍型在系統樹中交叉分布，表明不存在依照不同群體聚集在一起的現象.據此推測，濟源地理單元種群是三個地理單元種群中最古老的一個，而其余兩個地理單元種群則形成較晚，或者可能是由濟源單元種群遷移后分化而來.

3.3太行山獼猴的遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種進化的內在動力，遺傳變異程度的高低直接影響著物種進化速度的快慢.研究中對三個地理單元內5個群體的22個太行山獼猴個體的mtDNA 控制區片段HVI區域進行分析，Pi為0.010 64，表明太行山獼猴的遺傳多樣性程度較低.

影響遺傳多樣性的主要因素是在濟源單元(王屋山和黃楝樹)、焦作單元(五龍口和沁陽神農山)和新鄉單元(輝縣八里溝和關山)間，太行山獼猴的棲息地被人為或自然地分成隔離區域，分布呈現嚴重的片段化趨勢.種群間相距最近的有15 km，最遠達140 km，猴群之間可能難以進行有效的基因交流.因此，太行山獼猴種群的大小與其自身的生活史、遺傳進化程度、棲息地質量以及人類活動等諸多方面均有關，在物種保護時應綜合考慮，制定科學合理的保護規劃和實施計劃.

本研究發現，太行山獼猴種群的遺傳多樣性程度很低，地理單元之間的遺傳差異有的低(如濟源與焦作單元)、有的高(如濟源與新鄉以及焦作與新鄉單元)，地理單元之間缺乏有效的基因交流，而且到目前為止并沒有直接的證據表明各地理單元之間存在任何形式的基因交流.由彼此隔離的多個較小種群組成的太行山獼猴群體存在著因近親繁殖而走向基因衰退，甚至物種滅絕的危險.建議自然保護區加大管理力度，建立生態走廊，促進各地理單元之間的有效基因交流，以保護太行山獼猴的遺傳多樣性水平、提高其適應能力.

總之，對單倍型地理分布情況和地理單元之間遺傳差異水平的研究結果表明，太行山獼猴的遺傳變異主要存在于地理單元之間，而同一地理單元內各種群之間的遺傳變異并不顯著，因此應對其分別進行保護[18-19].應在各地理單元之間和各種群之間建立“生態走廊”，為太行山獼猴提供更加適宜的生存環境，促進各群體間基因的有效交流，使物種遺傳多樣性得以保護.本研究初步分析了太行山獼猴遺傳多樣性及其空間分布，為太行山獼猴進化顯著單元(evolutionarily significant units，ESUs)[20-21]和管理單元[21]的確定提供了依據.有關太行山獼猴與獼猴其他群體遺傳多樣性的比較尚待進一步探討.

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MtDNA-basedPopulationGeneticDiversityofRhesusMacaquesinMt.TaihangshanArea,Henan,China

XIE Dong-ming1, LU Ji-qi1, WANG Jian-dong2

(1.InstituteofBiodiversityandEcology,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001，China；2.AdministrationofTaihangshanMacaqueNationalNatureReserve,Jiyuan454650，China)

From November 2007 to February 2008,mtDNA-based population genetic diversity of rhesus macaques (Macacamulattatcheliensis) was investigated. Fecal samples were collected 5 separated groups among of 3 geographical units in Taihangshan Macaque National Nature Reserve (TMNNR) (35°11′N,112°16′E) in Henan,China. Total 22 mtDNA were extracted and used for genetic diversity analysis among different populations. The results showed that: ①the length of D-loop of mtDNA genome within 22 samples was 341 bp. Total 11 mutation sites,9 of transition and 2 of transversion,were identified among 22 samples;②there 9 haplotypes were found from 22 sequences within 3 geographical units;③the results from AMOVA indicated that 88.02% and 11.03% of the genetic variation happened among groups and within populations,respectively,while there 0.95% of the genetic variations occurred within groups. There were significant genetic differentiation,while no shared haplotypes being found,among Jiyuan,Jiaozuo and Xinxiang geographic units (P<0.01);and ④among the tested groups,Huanglianshu group in Jiyuan exhibited the highest haplotype number (3),the most haplotype diversity (0.833),the most nucleotide diversity (0.002 93) and the most average number of nucleotide differences (1.000). The results implied that Huanglianshu group should be protected with priority in the point of genetic diversity.

rhesus macaques (Macacamulatta);mtDNA;genetic diversity;Mt. Taihangshan

Q 16

A

1671-6841(2011)04-0089-07

2011-01-29

國家自然科學基金資助項目，編號30770381；鄭州大學引進人才科研基金資助項目.

謝東明(1983- )，男，碩士研究生，主要從事保護生物學研究；通訊作者：路紀琪(1964-)，男，教授，博士，主要從事動物生態學研究，E-mail:lujq@zzu.edu.cn.