N-二異丙氧磷酰化殼寡糖的合成與表征

馬 力, 李廣華, 李克讓, 李利民, 劉 蒲

(鄭州大學(xué) 化學(xué)系 河南 鄭州 450001)

N-二異丙氧磷酰化殼寡糖的合成與表征

馬 力, 李廣華, 李克讓, 李利民, 劉 蒲

(鄭州大學(xué) 化學(xué)系 河南 鄭州 450001)

通過殼寡糖和二異丙基亞磷酸酯在一種溫和條件下發(fā)生Atherton-Todd反應(yīng)，成功制備出了一種新型的殼寡糖含磷衍生物N-二異丙氧磷酰化殼寡糖.探討了水與無水乙醇的體積比、殼寡糖與三乙胺的摩爾比、殼寡糖與二異丙基亞磷酸酯的摩爾比以及反應(yīng)時間等因素對產(chǎn)品含磷量的影響.最后，對最優(yōu)條件下合成的產(chǎn)品進(jìn)行IR、1H-NMR、13C-NMR 以及31P-NMR的表征，證明二異丙氧磷酰基已經(jīng)成功嫁接到了殼寡糖的氨基上.這種簡單而有效的方法為N-磷酰化殼聚糖衍生物的制備提供了一條新的途徑.

殼寡糖； N-二異丙氧磷酰化殼寡糖； Atherton-Todd反應(yīng)； 表征

0 引言

殼聚糖是一種天然的陽離子生物材料，是聚-β-(1-4)-D-氨基葡萄糖衍生物，可以通過甲殼素的全部或部分的脫乙酰作用得到，它是自然界中數(shù)量僅次于纖維素的天然產(chǎn)物，也是迄今所發(fā)現(xiàn)的自然界中唯一的堿性多糖[1].由于其具有多樣的生物活性、良好的生物相容性、可降解性以及無毒性，使殼聚糖逐漸成為一種使用越來越廣泛的新型生物功能材料[2].近年來，隨著材料與生物醫(yī)藥科學(xué)的快速發(fā)展，殼聚糖及其衍生物在廢水處理、化妝品、藥物運輸、重金屬螯合[2-3]、電化學(xué)DNA生物傳感器[4]等領(lǐng)域中的應(yīng)用受到了廣泛的重視.

通過對殼聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾來得到新的功能材料是殼聚糖研究領(lǐng)域中最為引人矚目的.因為對殼聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾并不會改變其本身的基本結(jié)構(gòu).因此，在保留原有物理化學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，根據(jù)需要可以在殼聚糖分子鏈上引入其他基團(tuán)，從而合成出新的殼聚糖衍生物并產(chǎn)生相應(yīng)的物理化學(xué)及生物化學(xué)方面的性質(zhì)與功能[5].

對殼聚糖進(jìn)行磷酰化或磷酸化修飾是對殼聚糖修飾改性的途徑之一.制備殼聚糖含磷衍生物的方法有許多種，大致可分為兩大類，即殼聚糖與無機(jī)磷或有機(jī)磷試劑進(jìn)行反應(yīng)[6].大部分殼聚糖含磷衍生物是通過殼聚糖的羥基和(或)氨基與無機(jī)磷試劑反應(yīng)[7-9]，只有少數(shù)是通過與有機(jī)磷試劑反應(yīng)得到的[10-11].

作者通過Atherton-Todd反應(yīng)成功將二異丙氧磷酰基嫁接到了殼寡糖分子鏈的氨基上，生成了N-二異丙氧磷酰化殼寡糖，并對該產(chǎn)品進(jìn)行了IR,ICP,NMR和TG等分析，最后對其結(jié)果進(jìn)行了討論.

1 實驗部分

1.1試劑

殼寡糖(CS，5 000 Da)由金殼生物化學(xué)公司提供.異丙醇從北京化工廠購置.三氯化磷、三乙胺和四氯化碳從天津化學(xué)試劑一廠購置.其他試劑均為分析純.

1.2二異丙基亞磷酸酯(DIPPH)的制備

將115 mL異丙醇加入到250 mL三口燒瓶中，當(dāng)異丙醇的溫度降低并維持在-5 ℃時，通過恒壓滴液漏斗將44 mL的三氯化磷慢慢地逐滴加入到異丙醇中，并不斷攪拌，約3 h滴完.保持該溫度，繼續(xù)反應(yīng)2～3 h.反應(yīng)結(jié)束后，粗產(chǎn)品通過減壓蒸餾，在80～84 ℃(1.35 kPa) 收集餾分即得到純的DIPPH，產(chǎn)率為69.1%.DIPPH的表征結(jié)果如下：1H-NMR (DCCl3,δ):1.06～1.08 (d,3H,CH3in (CH3)2CH—),4.43～4.49 (m,1H,CH in (CH3)2CH—),5.38～5.48,7.67～7.71 (s,1H,P—H);31P-NMR (δ):4.4.

1.3N-二異丙氧磷酰化殼寡糖(DIPPCS)的合成

首先，在氮氣保護(hù)下將2 g殼寡糖溶解在40 mL的蒸餾水中.然后將20 mL無水乙醇和一定量的三乙胺(TEA)在不斷攪拌的情況下分別加到上述殼寡糖溶液中.當(dāng)體系溫度降到并保持在-5 ℃時，通過恒壓滴液漏斗慢慢地將一定摩爾比的DIPPH和CCl4的混合液滴加到體系中，約2 h滴完.保持該溫度，繼續(xù)反應(yīng)4 h，然后溫度升高到室溫再繼續(xù)反應(yīng)8～24 h.最后，將反應(yīng)后混合物傾入到350 mL丙酮中沉淀，靜置數(shù)小時后，將沉淀過濾，再將其裝入索氏提取器中用無水乙醇提取24 h.最后，產(chǎn)品在真空干燥箱中40 ℃時干燥24 h.DIPPCS的合成路線如圖1所示.

制備DIPPCS的最佳反應(yīng)條件通過正交試驗確定，其磷含量由ICP測得.

圖1 N-二異丙氧磷酰化殼寡糖的合成Fig.1 Synthesis of DIPPCS

1.4樣品的表征

1.4.1溶解性測試 將60 mg的樣品和2 mL的溶劑裝入試管中，在室溫下保存10 d左右.

1.4.2紅外 樣品的紅外光譜在室溫下通過KBr壓片法在Nicolet 380紅外光譜儀上測得.

1.4.3ICP 樣品中磷含量由ICP在Thermo Fisher IRIS上測得.

1.4.4核磁 樣品的1H,13C 和31P-NMR譜圖由Bruker-DTX-400 MHz光譜儀測得.將DIPPCS溶解在0.1 mol/L的DCl/D2O(30 g/L)中.1H 和13C-NMR譜的化學(xué)位移以TMS為標(biāo)準(zhǔn)，31P-NMR 譜的化學(xué)位移以85%的H3PO4為標(biāo)準(zhǔn).

1.4.5熱力學(xué)性質(zhì) 熱重分析在氮氣氣氛中進(jìn)行，由STA409PC熱重分析儀測得，其加熱速率為10 ℃/min.

2 結(jié)果和討論

2.1DIPPCS的合成

研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)體系中水和無水乙醇的體積比會對產(chǎn)品中磷的含量產(chǎn)生影響.從表1可以看出，當(dāng)V(H2O)∶V(CH3CH2OH)= 1∶0時w(P)最大，但是此時31P-NMR圖譜出現(xiàn)三個峰,這可能是由于有副產(chǎn)物生成所致.因此，水和無水乙醇的最佳體積比應(yīng)為2∶1.

表1 不同V(H2O)∶V(CH3CH2OH)時產(chǎn)品的磷含量*

*反應(yīng)條件：將4 g殼寡糖溶于蒸餾水中，水和乙醇的總體積為120 mL，n(CS)∶n(TEA)=1∶2,n(CS)∶n(DIPPH)=1∶2.

最優(yōu)反應(yīng)條件由正交試驗[L9(33)]確定.其中三個變量分別為殼寡糖與三乙胺的摩爾比、殼寡糖與DIPPH的摩爾比以及室溫下的反應(yīng)時間.每個變量都有三組值，其取值見表2，實驗結(jié)果見表3.從表3可以看出，三個變量對磷含量影響的大小順序為：殼寡糖與三乙胺的摩爾比>室溫下的反應(yīng)時間>殼寡糖與DIPPH的摩爾比.因此，反應(yīng)的最優(yōu)條件確定如下：n(CS)∶n(TEA)=(1∶4)～(1∶6);n(CS)∶n(DIPPH)=(1∶2)～(1∶4);室溫下的反應(yīng)時間為8～16 h.在最優(yōu)條件下得到的產(chǎn)品的最大含磷量為0.84%.

表2 L9 (33)正交試驗設(shè)計表

表3 L9 (33)正交試驗的數(shù)據(jù)

注：K1,K2,K3是每個量取3個值時磷含量的加和，k1,k2,k3分別是K1,K2,K3平均值，R是平均差.

2.2產(chǎn)品表征

以實驗8(在最優(yōu)條件下)得到的產(chǎn)品為例，對其進(jìn)行溶解性、IR、 ICP、1H,13C,31P-NMR、TG等表征.

表4是殼寡糖和DIPPCS分別在水、酸、堿和一些有機(jī)溶劑中的溶解性情況.由表4可以看出，DIPPCS可以溶于水和DMSO，但這個過程需要10 d左右.

表4 殼寡糖和DIPPCS的溶解性

注： 60 mg樣品和2 mL溶劑.++,可溶;+,部分溶解;±,溶脹;-,不溶.

DIPPCS的1H-NMR圖譜如圖3所示.峰的歸屬及化學(xué)位移如下所示：δ=4.76 (1—H);δ= 3.49～3.80(3—H,4—H,5—H,6—H);δ= 3.04～3.08(2—H)[12];δ=1.94 (COCH3)，該峰出現(xiàn)表明殼寡糖原料并沒有完全脫乙酰化，或者是由于殼寡糖鏈上的氨基被醋酸酸化了.8—H峰對應(yīng)于二異丙氧磷酰基中的甲基，化學(xué)位移為1.19 (單峰).但是，二異丙氧磷酰基中的7—H(CH)的峰將不能識別出來，因為它和吡喃葡萄糖的H(CH)處于同一出峰區(qū)域.化學(xué)位移為1.03～1.07 處的三重峰對應(yīng)于乙醇的甲基，這可能是由于純化過程中的溶劑殘留所致.

圖2 殼寡糖 (a) 和DIPPCS (b)的紅外光譜圖Fig.2 IR spectrum of chitosan (a) and DIPPCS (b)

圖3 DIPPCS的1H-NMR 圖譜Fig.3 1H-NMR spectrum of DIPPCS

圖4是DIPPCS的13C-NMR 圖譜.圖譜中共出現(xiàn)9組信號峰，位于55.8,60.2,69.0,76.2,75.0 和 97.5處，它們分別對應(yīng)于殼寡糖單元吡喃糖環(huán)的2—C,6—C,3—C,5—C,4—C和1—C[12].化學(xué)位移為22.9處的峰對應(yīng)于—COCH3中的—CH3，這也表明了殼寡糖原料并沒有完全脫乙酰化，或者是由于殼寡糖鏈上的氨基被醋酸酸化了.除了殼寡糖鏈上這些固有的峰以外，在化學(xué)位移為22.2和71.7處出現(xiàn)兩個新的峰，這兩個峰分別代表—OCH(CH3)2中的CH3和CH.以上結(jié)果表明，殼寡糖鏈上的氨基和二異丙氧磷酰基發(fā)生了磷酰化反應(yīng).

化學(xué)位移為14.6和57.4的峰分別代表乙醇中的伯碳和仲碳，這也可能是因為在純化的過程中有無水乙醇的殘留所致.

在DIPPCS的31P-NMR(圖5)中只在化學(xué)位移為8.1處出現(xiàn)一個單峰，這表明磷酰化反應(yīng)只發(fā)生在了殼寡糖鏈的氨基上[13].

圖4 DIPPCS的13C-NMR圖譜Fig.4 13C-NMR spectrum of DIPPCS

圖5 DIPPCS的31P-NMR 圖譜Fig.5 31P-NMR spectrum of DIPPCS

圖6 殼寡糖(a)和DIPPCS(b)的熱重分析Fig.6 TG of chitosan (a) and DIPPCS (b)

圖6為殼寡糖(a)和DIPPCS(b)的熱重分析圖.DIPPCS僅在207 ℃時表現(xiàn)出了比較明顯的熱降解過程.而殼寡糖在143 ℃和285 ℃時都表現(xiàn)出了比較明顯的熱降解.在230 ℃和310 ℃之間，殼寡糖的失重率低于DIPPCS的失重率，說明了在該溫度區(qū)間殼寡糖穩(wěn)定性好于修飾后的殼寡糖；在其他溫度區(qū)間，殼寡糖的穩(wěn)定性較修飾后的殼寡糖差.

3 結(jié)論

通過一步且簡單有效的Atherton-Todd 反應(yīng)成功地在殼寡糖的氨基上嫁接了二異丙氧磷酰基，合成出了DIPPCS. 經(jīng)實驗確定的最優(yōu)反應(yīng)條件為：水和無水乙醇的體積比為2∶1，n(CS)∶n(TEA)=(1∶4)～(1∶6)，n(CS)∶n(DIPPH)= (1∶2)～(1∶4)，室溫下的反應(yīng)時間為8～16 h.最優(yōu)條件下得到產(chǎn)品的最大含磷量為0.84%.

簡單高效的Atherton-Todd反應(yīng)又為合成殼聚糖含磷衍生物提供了一條可行的路線，通過該法合成出的衍生物可能在抗菌或生物醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)具有潛在應(yīng)用價值，在后續(xù)的工作中將會繼續(xù)探討.

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SynthesisandCharacterizationofDiisopropylPhosphorylChitosan

MA Li, LI Guang-hua, LI Ke-rang, LI Li-min, LIU Pu

(DepartmentofChemistry,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

A novel diisopropyl phosphoryl chitosan was successfully synthesized by Atherton-Todd reaction of chitosan with diisopropyl phosphite. The effects of reaction conditions including volume ratio of water to ethanol,molar ratio of chitosan to triethylamine,molar ratio of chitosan to diisopropyl phosphite,and reaction time at the room temperature on the phosphorus content were investigated. IR,1H-NMR,13C-NMR and31P-NMR showed that diisopropyl phosphoryl group was grafted on the amino group of chitosan. The results of TG were also investigated.By this simple and efficient synthetic method a new approach to the preparation of N-phosphoryl chitosan derivatives was provided.

chitosan;diisopropyl phosphoryl chitosan;Atherton-Todd reaction;characterization

TQ 316.6+5

A

1671-6841(2011)04-0084-05

2010-11-10

國家自然科學(xué)基金資助項目,編號20872134.

馬力(1984-)，男，碩士，主要從事高分子功能材料研究；通訊作者：劉蒲(1965-)，女，教授，博士，主要從事功能材料研究.