NF-κB/IκB在二苯乙烯苷抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的表達(dá)變化

龍石銀，張彩平，高細(xì)強(qiáng)，喬新惠，黃良珠，佟 麗，陳武哲，田 英

二苯乙烯苷(2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，TSG)是從中藥何首烏中提取分離得到的一種含多酚結(jié)構(gòu)的水溶性活性成分，具有抗氧化、抗炎、降脂、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)等作用［1-4］，但分子機(jī)制尚未明確。核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡等密切相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞靜息狀態(tài)下與NF-κB抑制因子(inhibitor of NF-κB，IκB)結(jié)合形成復(fù)合物，NF-κB/IκB途徑被認(rèn)為是炎癥及凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵［5-6］，TSG是否能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB/IκB途徑抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，觀察TSG對(duì)凋亡內(nèi)皮細(xì)胞的作用及對(duì)NF-κB/IκB表達(dá)的影響，初步探討TSG保護(hù)內(nèi)皮功能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVECs(編號(hào):C-003-5C)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所上海細(xì)胞庫(kù)。TSG為中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品(編號(hào):110844-200908)。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，MTT、胰蛋白酶、DMSO均購(gòu)自Amresco公司，蛋白裂解液和Hoechst 33258熒光染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自MBI公司，抗NF-κB p65、IκB、GAPDH 抗體購(gòu)自博士德生物工程有限公司，其余均為分析純級(jí)試劑。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%飽和濕度條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為3組:①空白對(duì)照組;② H2O2組:以 300 μmol·L-1H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;③ TSG組:10 μmol·L-1TSG預(yù)處理 24 h 后，再加 300 μmol·L-1H2O2孵育 24 h。

1.3 Hoechst 33258染色觀察內(nèi)皮細(xì)胞凋亡形態(tài)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組給予不同因素處理后，每孔用4%多聚甲醛500 μl于 4℃固定過(guò)夜，PBS清洗3遍后，每孔加入500 μl終濃度為10 mg·L-1的 Hoechst 33258，37℃避光搖床上振蕩30 min，熒光顯微鏡觀察、攝片。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按分組要求給予不同的處理因素，每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加5 g·L-1的MTT 20 μl培養(yǎng)4h后棄上清，加DMSO 150 μl/孔，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值，細(xì)胞增殖率/%=試驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 TSG處理細(xì)胞24 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，離心，去上清，PBS漂洗2遍，加入冰預(yù)冷的75%的乙醇固定，4℃過(guò)夜，PI單染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 RT-PCR檢測(cè)NF-κB、IκB基因的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，鑒定RNA完整性及純度。各組分別取5μg總RNA，按照MBI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，cDNA產(chǎn)物于 -20℃保存。GAPDH上游引物為5′-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3′，下 游 引 物 為 5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，退火溫度 60.0℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度648 bp;NF-κB上游引物為5′-GGACCAGCAAAGGTTATTGTTC-3′，下 游 引 物 為 5′-TTATACACGCCTCTGTCATTCG-3′，退火溫度 57.8 ℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度 217 bp;IκB 上游引物為 5′-TCACCAACCAGCCAGAAAT-3′，下游引物為 5′-CATCAGCACCCAAGGACAC-3′，退火溫度 60.0℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度 267 bp。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并對(duì)DNA目的條帶進(jìn)行掃描，以GAPDH為內(nèi)參，分析各基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。每組取60μg蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%牛奶的封閉液封閉12 h，加入1∶1 000稀釋的抗NF-κB p65、IκB、GAPDH 一抗，4℃ 孵育過(guò)夜，TBST 緩沖液(0.05%Tween-20的TBS緩沖液)洗膜10 min×3次，以1∶5 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育 1～2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，膠片顯影，掃描膠片后用凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)光密度值。

2 結(jié)果

2.1 Hoechst33258染色觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài) 熒光顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞的胞核形態(tài)大小較為一致，均勻藍(lán)染，H2O2組凋亡細(xì)胞增多，凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞染色質(zhì)濃染，核染色較明亮，可見(jiàn)凋亡小體;TSG組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少(Fig 1)。

2.2 MTT法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖率 MTT結(jié)果顯示，H2O2處理組內(nèi)皮細(xì)胞的增殖率較對(duì)照組下降，差異有顯著性(P＜0.01);TSG預(yù)處理組細(xì)胞增殖率較H2O2組升高(P＜0.01)，表明TSG預(yù)處理能改善H2O2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，增加內(nèi)皮細(xì)胞的增殖率(Fig 2)。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、H2O2組和TSG組的凋亡率分別為(2.0±0.2)%、(28.6±3.5)%和(14.9±3.2)%，與空白對(duì)照組相比，H2O2組細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.01);TSG預(yù)處理HUVECs 24 h后，細(xì)胞凋亡率降低，與 H2O2組相比，差異有顯著性(P＜0.01)，表明TSG能抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

Fig 1 Morphological observation of HUVECs(Hoechest dye，×200)A:Control;B:H2O2;C:TSG

Fig 2 Proliferation rates of HUVECs＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs H2O2

2.4 TSG對(duì)H2O2誘導(dǎo)凋亡內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，H2O2組NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)增加(P＜0.01);經(jīng)TSG預(yù)處理后，NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)較H2O2組降低，差異有顯著性(P ＜0.01)。見(jiàn)Fig 3，4。

Fig 3 NF-κB mRNA expression of HUVECs

Fig 4 NF-κB protein expression of HUVECs

2.5 TSG對(duì)H2O2誘導(dǎo)凋亡內(nèi)皮細(xì)胞IκB表達(dá)的影響 RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，H2O2處理后，內(nèi)皮細(xì)胞中IκB mRNA及蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;經(jīng)TSG預(yù)處理后，細(xì)胞中IκB mRNA及蛋白水平均較H2O2模型組升高，P＜0.01。見(jiàn) Fig 5，6

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液和組織之間的屏障，具有多種重要的生物學(xué)功能，在氧化應(yīng)激等因素刺激下［7］，會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡，并導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，從而啟動(dòng)和參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度凋亡會(huì)促進(jìn)As斑塊糜爛，繼發(fā)血栓形成［8］，因此，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞成為防治As研究的熱點(diǎn)之一。

研究發(fā)現(xiàn)，As斑塊和組織中存在明顯的NF-κB激活和 IκBα 的降解［9］，NF-κB/IκB 途徑是炎癥反應(yīng)和凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵，在形成動(dòng)脈粥樣硬化的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路中，該通路是其中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。但是，NF-κB在促進(jìn)細(xì)胞凋亡還是抑制細(xì)胞凋亡方面仍存在爭(zhēng)議。p65過(guò)表達(dá)時(shí)，NF-κB抑制細(xì)胞凋亡［10］，NF-κB的激活能抑制小鼠肝細(xì)胞凋亡并對(duì)肝細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［11］。但當(dāng)c-Rel表達(dá)增加時(shí)，NF-κB則促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Campbell等［12］發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制抗凋亡基因的表達(dá)使細(xì)胞發(fā)生凋亡，在紫外線誘導(dǎo)人黑色素瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)現(xiàn)NF-κB表達(dá)的下調(diào)也伴隨著細(xì)胞凋亡數(shù)的減少。Aoki等［13］研究證實(shí)在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中，NF-κB被激活并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;間歇性高糖條件下也可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并激活NF-κB信號(hào)通路［14］。這些研究結(jié)果均表明，NF-κB在細(xì)胞凋亡中的作用是復(fù)雜的，NF-κB在細(xì)胞凋亡中是起抑制凋亡還是促進(jìn)凋亡作用取決于不同的刺激因素及細(xì)胞類(lèi)型，并與激活的NF-κB亞單位的種類(lèi)及數(shù)量有關(guān)，對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞而言，NF-κB 能促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6，13-15］。

Fig 5 IκB mRNA expression of HUVECs

Fig 6 IκB protein expression of HUVECs

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明TSG對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB活化而降低炎性因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)［16］。但TSG是否通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡基因的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在H2O2誘導(dǎo)HUVECs凋亡的模型中發(fā)現(xiàn)，300μmol·L-1的H2O2即可上調(diào) NF-κB p65 mRNA及蛋白水平，同時(shí)IκB mRNA及蛋白表達(dá)量降低，此時(shí)細(xì)胞增殖率明顯下降，細(xì)胞凋亡率升高，說(shuō)明了在HUVECs凋亡的過(guò)程中H2O2可能通過(guò)促進(jìn)NF-κB的抑制蛋白 IκB 的降解，使 NF-κB 信號(hào)通路激活，NF-κB p65活化入核，與核內(nèi)DNA結(jié)合，轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。與H2O2損傷組相比，10 μmol·L-1TSG 預(yù)處理組 NF-κB p65mRNA 及蛋白表達(dá)減低，IκB的mRNA及蛋白表達(dá)量升高，提示TSG可能通過(guò)抑制了NF-κB/IκB信號(hào)通路的激活，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮的作用。

［1］Liu Q L，Xiao J H，Ma R，et al.Effect of 2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-beta-d-glucoside on lipoprotein oxidation and proliferation of coronary arterial smooth cells［J］.J Asian Nat Prod Res，2007，9(6-8):689-97.

［2］崔慧輝，田 英，龍石銀.二苯乙烯苷抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用和機(jī)制［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9(20):3968-71，3982.

［2］Cui H H，Tian Y，Long S Y.The effective mechanism of 2，3，5，4‘-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside in anti-atherosclerosis［J］.Prog Mod Biomed，2009，9(20):3968-71，3982.

［3］Xu X L，Huang Y J，Wang Y Q，et al.2，3，4′，5-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glu-coside inhibits platelet-derived growth factorinduced proliferation of vascular smooth muscle cells by regulating the cell cycle［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2011，38(5):307-13.

［4］李彩蓉，蔡 飛，黎 榮，等.二苯乙烯苷對(duì)高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)的調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(4):272-3.

［4］Li C R，Cai F，Li R，et al.Modulate effects of tetrahydroxystilbene glucoside on senescence-related signaling of rat mesangial cells induced by high glucose［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(4):272-3.

［5］Harvey K A，Walker C L，Xu Z，et al.Oleic acid inhibits stearic acid-induced inhibition of cell growth and pro-inflammatory responses in human aortic endothelial cells［J］.J Lipid Res，2010，51(12):3470-80.

［6］Liu X，Sun J.Endothelial cells dysfunction induced by silica nanoparticles through oxidative stress via JNK/p53 and NF-kappaB pathways［J］.Biomaterials，2010，31(32):8198-209.

［7］Bonomini F，Tengattini S，F(xiàn)abian A，et al.Atherosclerosis and oxidative stress［J］.Histol Histopathol，2008，23(3):381-90.

［8］Trostdorf F，Landgraf C，Kablau M，et al.Increased endothelial cell apoptosis in symptomatic high-grade carotid artery stenosis:preliminary data［J］.Vasc Endovasc Surg，2007，33:65-8.

［9］Chen H，Li D，Mehta J L.Modulation of matrixmetallo proteinase1，its tissue inhibitor and nuclear factor-kappa B by losartan in hypercholesterolemic rabbits［J］.Cardiovasc Pharmacol，2002，39(3):332-9.

［10］Chen X，Kandasamy K，Srivastava R K.Differential roles of RelA(p65)and c-Rel subunits of nuclear factor kappa B in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand signaling［J］.Cancer Res，2003，63:1059-66.

［11］崔香丹，金武丕，孟繁平.Bcl-2和NF-κB在大鼠酒精性肝病中的表達(dá)及相關(guān)性［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(1):55-8.

［11］Cui X D，Jin W P，Meng F P.Expression of Bcl-2 and NF-κB in alcoholic liver disease in rats and their dependability［J］.Chin J Mod Med，2009，19(1):55-8.

［12］Campbell K J，Rocha S，Perkins N D.Active repression of antiapoptotic gene expression by RelA(p65)NF-kappa B［J］.Mol Cell，2004，13:853-65.

［13］Aoki M，Nata T，Morishita R，et al.Endothelial apoptosis induced by oxidative stress through activation of NF-κB:antiapoptotic effect of antioxidant agents on endothelial cells［J］.Hypertension，2001，38(1):48-55.

［14］Chen G，Chen Y F，Chen H F，et al.The effect of NF-κB pathway on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by intermittent high glucose［J］.Mol Cell Biochem，2011，347:127-33.

［15］Chou C H，Chen S U，Cheng J C.Radiation-induced interleukin-6 expression through MAPK/p38/NF-kappaB signaling pathway and the resultant antiapoptotic effect on endothelial cells through Mcl-1 expression with sIL6-Ralpha［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2009，75(5):1553-61.

［16］龍石銀，崔慧輝，張彩平，等.二苯乙烯苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核因子-κB和腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響［J］. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2010，18(17):510-3.

［16］Long S Y，Cui H H，Zhang C P，et al.Effect of 2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside on the expression of NF-κB and TNF-α in human umbilical vein endothelial cell injured by H2O2［J］.Chin J Arterioscl，2010，18(17):510-3