非特異性抑制脊髓蛋白酪氨酸磷酸酶的活性對炎性疼痛的影響及其機(jī)制

李 帥，楊 嫻，索占偉，時 蕾，劉燕妮，曹 靜，許英明，胡曉東

脊髓背角NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)型谷氨酸受體在慢性病理性疼痛的形成和維持中發(fā)揮重要作用［1］。外周組織或神經(jīng)損傷，通過促進(jìn)NMDA受體的突觸輸送(synaptic trafficking)、增加NMDA受體的突觸表達(dá)［2］，或者通過催化NMDA受體發(fā)生磷酸化、提高 NMDA受體的鈣通透性［3］，誘發(fā) NMDA受體的功能亢進(jìn);抑制脊髓NMDA受體，則能明顯緩解慢性炎性疼痛或神經(jīng)病理性疼痛癥狀［4］。因此，NMDA受體成為重要的鎮(zhèn)痛干預(yù)靶點。

NMDA受體是由 NR1、NR2(NR2A-NR2D)、NR3(NR3A-NR3B)亞基通過組合而成的異源性四聚體。脊髓最常見的NMDA受體由兩個NR1和兩個NR2A(簡稱 NR2A受體)或兩個 NR1和兩個NR2B(簡稱NR2B受體)所組成。對NMDA受體亞型的深入研究發(fā)現(xiàn):NR2B受體與慢性疼痛的關(guān)系尤為密切［4］。資料顯示:外周組織損傷之后，脊髓NR2B受體的功能會異常升高，特異性抑制NR2B受體，會產(chǎn)生和非特異性NMDA受體抑制劑相似的鎮(zhèn)痛效應(yīng)［2，5］，提示 NR2B 受體在慢性疼痛中的核心作用。

NR2B受體的功能受到多種因素的調(diào)節(jié)，其中，在NR2B的第1472位包含一個關(guān)鍵性的酪氨酸殘基(即:NR2B-Y1472)［6］。Src 家族酪氨酸激酶對NR2B-Y1472的磷酸化，不僅提高NR2B受體的鈣通透性，而且明顯增強(qiáng)NR2B受體在突觸中的表達(dá)、易化NR2B受體介導(dǎo)的痛覺信息的突觸傳遞［5］。但值得關(guān)注的是:Src家族酪氨酸激酶的活性以及NR2B-Y1472的磷酸化，都受到酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)的控制［7－8］。因此，本研究設(shè)想:PTPs可能直接或間接的影響NR2B受體的酪氨酸磷酸化水平，參與中樞敏感化的形成過程。為此，本研究建立慢性炎性疼痛模型，通過鞘內(nèi)注射PTPs抑制劑正釩酸鈉(sodium orthovanadate，Na3VO4)，探討PTPs對炎性疼痛的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Na3VO4(上海中秦);完全弗氏佐劑(CFA，Sigma);多克隆兔抗 NR2B抗體 (Millipore Corporation，Temecula，CA，USA);多克隆兔抗NR2B-Y1472磷酸化抗體 (Millipore);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(Jackson Immuno Research Laboratories，Baltimore，PA，USA);Von Frey 纖 維(Stoelting，Wood Dale，IL，USA);PVDF膜 (Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 正釩酸鈉的活化 為使正釩酸鈉解聚、增強(qiáng)正釩酸鈉的PTPs抑制活性，本研究首先制備200 mmol·L－1的正釩酸鈉水溶液，隨后調(diào)節(jié) pH至10.0，煮沸、直至無色，冷卻至室溫，重新調(diào)節(jié)pH至10.0，再次煮沸至無色，重復(fù)3～4次，直至溶液無色。調(diào)節(jié)pH至10.0，置于－20℃?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 疼痛模型 ♂昆明種小鼠，18～22 g，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供。左后足底皮下注射20 μl的CFA，對照組注射等容量的生理鹽水［2］。

1.2.3 縮足閾值的測定 在造模前、后，以 Up-Down法測定Von Frey纖維誘發(fā)的小鼠機(jī)械性縮足閾值 (paw withdrawal threshold，PWT)［5］。

1.2.4 運動功能測試 以翻正反射時間和“抓/爬”滯留時間，評價動物的運動功能［10］。翻正反射時間＜1.5 s為正常;“抓/爬”能力測試時，小鼠置于垂直的金屬網(wǎng)格上，滯留時間＞30 s為正常。

1.2.5 鞘內(nèi)給藥 小鼠用乙醚淺麻醉，一根25 μl的無菌微量進(jìn)樣器針頭，于L5-L6棘突間隙插入，以產(chǎn)生空洞感、并伴隨動物的輕微甩尾，作為針尖進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的標(biāo)志，緩慢推注藥物5 μl，對照組注射等容量的生理鹽水［5］。

1.2.6 磷酸化的測定 小鼠用苯巴比妥鈉 (30 mg·kg－1，ip.)麻醉，暴露并分離 L4-L5節(jié)段脊髓背角，在 4℃ 的 RIPA 緩沖液 ［50 mmol·L－1Tris·HCl，pH 8.0，150 mmol·L－1NaCl，1 mmol·L－1EDTA，1.0%NP-40(V/V)，1 g·L－1SDS，5 g·L－1sodium deoxycholate，5 mmol·L－1EGTA，10 mmol·L－1NaF，1 mmol·L－1Na3VO4，1 mmol·L－1PMSF，以及 aprotinin、chymostatin、leupeptin、antipain、pepstatin 各 1 g·L－1］中，制備組織勻漿;14 000×g離心10 min(4℃)，測定上清的總蛋白含量，Western blot檢測NR2B-Y1472的磷酸化水平。隨后，PVDF膜用洗脫緩沖液［stripping buffer，成分:5 mmol·L－1Tris·HCl，pH 6.8，20 g·L－1SDS，0.5% β-mercaptoethanol(V/V)］在 70℃洗脫 30 min，以抗 NR2B的特異性抗體檢測 NR2B的含量［5］。

1.2.7 免疫印跡 20 μg蛋白上樣，8%SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，洗滌，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯像，Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 NR2B-Y1472磷酸化的免疫反應(yīng)密度值與NR2B的免疫反應(yīng)密度值相比(NR2B-pY1472/NR2B)，以消除上樣量的差異。各處理組與對照組相比較，結(jié)果以ˉ±s表示。采用One-way ANOVA結(jié)合post-hoc Tukey HSD檢驗，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 鞘內(nèi)注射正釩酸鈉對正常小鼠縮足閾值的影響 為觀察正釩酸鈉對正常動物痛閾的影響，本實驗取小鼠鞘內(nèi)注射正釩酸鈉50、100和200 ng，檢測縮足閾值(PWT)的變化，發(fā)現(xiàn):正釩酸鈉對正常動物的PWT值無明顯影響(Fig 1)，各時間點的PWT值和生理鹽水注射組動物相比較，差異無顯著性，提示:在生理條件下，脊髓PTPs無活性或活性較低，對脊髓痛覺信息的傳遞與整合無影響。各劑量的正釩酸鈉也不影響小鼠的運動功能，動物的翻正反射正常(均＜1.5 s)，抓/爬能力正常(均＞30 s)。

Fig 1 Intrathecal application of sodium orthovanadate(Na3VO4 50 ng，100 ng，200 ng)has no significant effects on the paw withdrawal threshold values of intact mice(±s，n=4)

2.2 鞘內(nèi)注射正釩酸鈉對CFA誘發(fā)的炎性疼痛的影響 注射CFA前、后連續(xù)檢測縮足閾值的變化，發(fā)現(xiàn):注射CFA后24 h，小鼠的縮足閾值明顯降低(Fig 2)，表現(xiàn)出明顯的機(jī)械性痛覺超敏，說明炎性疼痛的形成。此時，鞘內(nèi)注射正釩酸鈉50 ng，對炎性疼痛小鼠的PWT值無影響(Fig 2);增大正釩酸鈉的劑量至100 ng和200 ng，則炎性疼痛小鼠的PWT值會快速升高(Fig 2)，在給藥后30 min，CFA組動物的PWT值從(0.24±0.07)g升高至(1.07±0.51)g(P＜0.05，n=4)和(1.38±0.47)g(P ＜0.05，n=4)，提示:外周組織損傷能夠激活脊髓PTPs，使之在痛覺超敏的形成中發(fā)揮重要作用;抑制PTPs的活性，則劑量依賴性地緩解炎性疼痛癥狀。

Fig 2 Paw withdrawal threshold of mice significantly decreases one day after intradermal injection of complete Freund’s adjuvant(CFA;20 μl)，which，however，can be reversed by intrathecal application of sodium orthovanadate(Na3VO4)in a dose-dependent manner(ˉ±s，n=4)

2.3 鞘內(nèi)注射正釩酸鈉對CFA誘發(fā)的NR2B酪氨酸磷酸化的影響 為探討脊髓PTPs對NMDA受體的調(diào)節(jié)作用，本實驗在注射CFA后24 h鞘內(nèi)給予正釩酸鈉100 ng，經(jīng)過30 min后，立即分離損傷側(cè)脊髓背角，測定NR2B-Y1472的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn):注射CFA之后，脊髓背角NR2B-Y1472的磷酸化水平會明顯升高(Fig 3)，和生理鹽水對照組動物相比較差異具有顯著性(P＜0.05)，說明:CFA誘發(fā)的NR2B-Y1472的磷酸化參與痛覺超敏的形成;而用正釩酸鈉100 ng處理炎性疼痛動物30 min后，NR2B-Y1472的磷酸化水平會重新降低(Fig 3)，和生理鹽水對照組動物相比較，差異不具有顯著性(P＞0.05)，提示:正釩酸鈉通過抑制脊髓PTPs的活性，能夠逆轉(zhuǎn)組織損傷誘發(fā)的NR2B的酪氨酸磷酸化，有效緩解炎性疼痛癥狀。

3 討論

目前認(rèn)為，酪氨酸磷酸酶(PTPs)的作用在于催化底物的去磷酸化;抑制PTPs的活性，會升高其底物的酪氨酸磷酸化水平。但本研究首次發(fā)現(xiàn):鞘內(nèi)注射PTPs抑制劑正釩酸鈉，不但不會升高，反而會降低NR2B-Y1472的磷酸化水平，明顯緩解慢性炎性疼痛癥狀，提示:外周組織損傷可能激活脊髓PTPs，促進(jìn)NR2B的酪氨酸磷酸化，誘發(fā)NR2B受體的功能亢進(jìn)，最終導(dǎo)致慢性疼痛的形成。

Fig 3 Intrathecal application of sodium orthovanadate(Na3VO4 100 ng)for 30 min represses the phosphorylation of NR2B subunit at Tyr1472(NR2B-pY1472)in spinal dorsal horn of mice one day after CFA injection(n=4)

如何解釋這一看似“矛盾”的結(jié)果呢?大量的資料證實:Src家族酪氨酸激酶尤其是其成員Src和Fyn，能夠直接催化 NR2B-Y1472 發(fā)生磷酸化［5］;這一作用被認(rèn)為是誘發(fā)和維持慢性炎性疼痛的關(guān)鍵性事件。然而，在Src家族激酶的分子結(jié)構(gòu)中，存在2個重要的、保守的酪氨酸磷酸化位點，即:Src激酶催化活性區(qū)域(kinase domain)第418位的酪氨酸(Y418)以及Src的C-末端第529位酪氨酸(Y529);Y418的磷酸化和Src家族激酶的活性成正相關(guān)［11］，而Y529發(fā)生磷酸化則會和Src的SH2(Src Homology-2)結(jié)構(gòu)域發(fā)生分子內(nèi)的結(jié)合，通過分子變構(gòu)而導(dǎo)致Src激酶的滅活［11］;雖然Y418和Y529的磷酸化都受到PTPs的控制，但有意思的是:某些PTPs能夠去磷酸化Y418，使得Src激酶失活，因此，這些PTPs的作用可能是“抑制性”的［12］;然而另一些PTPs則能夠選擇性地去磷酸化Y529，暴露Src的激酶活性區(qū)域，導(dǎo)致Src激酶的激活，因而這些PTPs的作用可能是“興奮性”的［13］。本研究結(jié)果顯示:PTPs的非特異性抑制劑正釩酸鈉，能夠明顯降低炎性疼痛小鼠脊髓背角NR2B-Y1472的磷酸化，明顯緩解炎性疼痛癥狀，提示:外周組織損傷，可能優(yōu)先激活脊髓背角中的“興奮性”PTPs，或者組織損傷之后“興奮性”PTPs的功能會相對占優(yōu)勢，從而使“興奮性”PTPs在中樞敏感化的形成中發(fā)揮重要作用。PTPs大家族包含有眾多的成員［12，14］，究竟哪種 PTPs表達(dá)于脊髓背角以及外周組織損傷，究竟激活哪種PTPs參與慢性疼痛的形成等問題，尚有待于大量而細(xì)致的研究。

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