鞘內注射巴氯酚對神經病理性痛大鼠的鎮痛作用及其對脊髓GABA轉運體-1的影響

朱珊珊，譚珊珊，，曾因明

巴氯酚(baclofen，Bac)是 GABAB受體的激動劑，在脊髓的中間神經元可產生突觸前和突觸后抑制效應。在行全膝關節置換術的患者鞘內使用巴氯酚，可減少阿片類藥物的用量和慢性疼痛的形成［1］。目前的研究認為，巴氯酚的鎮痛作用可能與其促進抑制疼痛信息傳遞的遞質如GABA、內啡肽的釋放有關［2］，但具體機制還不清楚。GABA轉運體(GABA transporter，GAT)能夠高效地將突觸間隙的GABA轉運回細胞內，從而終止GABA的突觸后效應，因此GAT數目和功能的改變將直接影響間隙內GABA的含量。已有研究表明，大鼠脊髓水平GAT-1表達的上調參與神經病理性疼痛的形成。巴氯酚的鎮痛作用是否與其對GAT-1的影響有關，目前還不清楚。因此，本研究在坐骨神經結扎致神經病理性痛大鼠模型上，采用行為學、免疫組織化學和Western blot方法，觀察鞘內應用GABAB受體激動劑巴氯酚對神經病理性痛大鼠觸誘發痛、熱痛敏等特征性痛覺行為學反應和脊髓GAT-1蛋白表達的影響，以探討巴氯酚對神經病理性痛的鎮痛作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 神經病理性疼痛動物模型的制備 慢性坐骨

神經結扎損傷(chronic constriction injury，CCI)致神經病理性痛大鼠模型［3］的制備 SD♂大鼠，(250±20)g，飼養1周。戊巴比妥鈉40 mg·kg－1腹腔注射后，選擇左側后肢，消毒皮膚，切開皮膚，分離皮下及肌肉，暴露坐骨神經，以3-0絲線相隔1 mm松結扎4道，直到神經外膜稍稍收壓為止，打結時可見左下肢肢體輕微抽動。逐層縫合。假手術組步驟與神經結扎大鼠相同，但只暴露神經，而不加結扎。

1.2 鞘內給藥方法 將大鼠頭置于麻醉箱內，吸入0.4 ml異氟烷。一手定位大鼠L5-6腰椎棘突，16 G粗針破皮，另一手持25 μl微量注射器，按 Mestre等［4］報道的方法刺入蛛網膜下腔，出現典型鼠尾側向甩動和抖動視為穿刺成功。藥物均溶于10 μl生理鹽水中，于10 s內推完。停止吸入異氟烷后動物將在1 min內恢復翻正反射。巴氯酚〔R(±)baclofen〕購自美國Sigma公司。

1.3 動物分組 行為學實驗部分，采用結扎大鼠左側坐骨神經的方法建立神經病理痛模型，神經結扎后d 3出現痛覺過敏的大鼠32只隨機分為4組(n=8):Bac1組、Bac2組、Bac3組、NS組，鞘內分別注射10 μl的 0.1、0.3、1.0 μg 巴氯酚、生理鹽水。分別于給藥前、給藥后 0.5、1、2、4、8、12、24 h 測大鼠機械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawl threshold，MWT)和熱刺激縮足反射潛伏期(thermal withdrawl latency，TWL)以及運動功能。免疫組織化學實驗部分，大鼠分為NS組與Bac組，鞘內分別給予0.3 μg 巴氯酚(10 μl)或生理鹽水10 μl，分別于給藥前、給藥后1、4、8 h取大鼠脊髓腰段，用免疫組織化學方法檢測脊髓節段GAT-1免疫陽性染色的灰度值。Western blot實驗部分，SD大鼠分為NS組與Bac組，鞘內分別給予 0.3 μg巴氯酚(10 μl)或生理鹽水10 μl，分別于給藥前、給藥后30 min、1、2、4、8、12 和 24 h 取大鼠脊髓腰段，用 Western blot方法測定脊髓節段GAT-1蛋白含量。

1.4 行為學指標的測定

1.4.1 機械縮足反射閾值(mechanical withdrawl threshold，MWT)的測定 按Chaplan等［5］報道方法測定MWT。置大鼠于透明的有機玻璃箱中，底為(0.5×0.5)cm2的鐵絲網。實驗前使之適應30 min。以不同折力(buckling force)的Von Frey纖毛(Stoelting公司，美國)刺激大鼠足底。從2.0 g開始，以up-down法推測閾值，并在閾值上下各刺激5次，用內推法算出50%反應閾值(即引起5次試驗中2.5次反應的值)。最大折力為15 g，大于此值時記為15 g。每次實驗至少間隔15 s，并等刺激引起的行為反應(如舔足等)完全消失后再給予下一次刺激。

1.4.2 熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawl latency，TWL)的測定 將有機玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，將大鼠放入有機玻璃箱內，使其自由活動30 min以適應測試環境和溫度。室溫穩定在25℃±1.0℃。按 Hargreaves等［6］法用 BME-410A 型熱痛刺激儀(中國醫學科學院生物醫學研究所制作)照射大鼠足底。照射開始至大鼠出現抬腿回避時間為TWL。刺激部位為緊貼玻璃板的后爪部分。當后爪移動時，停止照射。照射自動切斷時間為20 s，以防止組織損傷。整個實驗中，熱刺激強度保持相同。重復刺激5次，取后3次TWL的平均值［7］。

1.4.3 運動功能評分 為了評定和排除藥物對大鼠運動功能的影響，給藥后觀察動物運動情況并根據下述情況進行評分［8］:0分:沒有運動改變，正常的行走;1分:輕度運動功能減弱，對足底的刺激縮爪反應正常;2分:自主活動減弱，中度運動功能減弱，正常行走，對足底的刺激有縮爪反應，但減弱;3分:不能自主活動，不能行走，對足底的刺激沒反應。評分≥2，表示有明顯的運動功能障礙。

1.5 免疫組織化學染色 大鼠在戊巴比妥鈉(40 mg·kg－1)腹腔注射麻醉下行左心室穿刺灌注，取腰段脊髓，4%多聚甲醛后固定。行連續冰凍切片，切片厚度為40 μm，每間隔5張取1張，收集在0.01 mol·L－1PBS液中。切片沖洗孵育后，加入GAT-1一抗(1∶300)。4℃孵育48 h后用PBS洗去未結合的一抗，順序加入工作液。以上各步驟均用0.01 mol·L－1PBS徹底漂洗切片，最后用即用型DAB顯色，干燥，脫水，透明，中性樹膠封片。每只動物隨機取脊髓片3張，高倍鏡下以Olympus DP11數碼相機在脊髓背角截取一屏，以Leica圖像分析系統對上述部位GAT-1的染色灰度進行分析。

1.6 Western blot 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取腰段脊髓放入液氮中冷凍保存備用。提取胞膜蛋白，取40 μg蛋白樣本SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后電轉至硝酸纖維素膜上，與GAT-1一抗(1∶300)孵育過夜，加入兔二抗(1∶500)，孵育沖洗，用NBT/BCIP進行呈色反應，反應條帶進行定量分析。

2 結果

各組大鼠基礎 MWT分別為:(13.2±1.7)g、(12.9±1.9)g、(13.5±1.4)g、(13.4 ±1.5)g;基礎TWL分別為:(14.2±3.9)s、(15.4±4.0)s、(16.1±3.8)s、(15.5 ±4.3)s。坐骨神經結扎后 d 3，各組大鼠的MWT分別降低為:(4.2±2.1)g、(4.9±2.7)g、(4.5±1.7)g、(4.5±1.7)g;TWL 分別縮短為:(6.8 ±2.4)s、(6.6 ±1.6)s、(7.4 ±1.9)s、(7.42±2.7)s;均明顯低于各自的基礎值(P＜0.01)。

2.1 鞘內注射巴氯酚對坐骨神經松結扎致神經病理性痛大鼠MWT和TWL的影響 鞘內分別注射0.1、0.3、1 μg 巴氯酚后0.5 ～2 h，Bac1 組、Bac2 組與Bac3組大鼠MWT和TWL均較NS組明顯升高(P ＜0.01，P ＜0.05)，鞘內給藥后4 h，Bac2與 Bac3組大鼠MWT和TWL仍較 NS組明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，但Bac1組與NS組相比無差別(P＞0.05)，給藥后 8 h，Bac1組與 Bac2組 MWT與TWL均降至給藥前水平，但Bac3組MWT與TWL仍高于NS組(P＞0.05)。見Tab 1，2。

2.2 鞘內注射巴氯酚對坐骨神經結扎致神經病理性痛大鼠運動功能的影響 鞘內分別注射0.03、0.3 μg巴氯酚后，大鼠均能保持自主活動，對足底的刺激反應靈敏，運動功能評分均為0或1。鞘內注射1 μg巴氯酚后，在該實驗組的8只動物中有5只大鼠出現不同程度的自主運動障礙，運動功能評分均≥2，持續時間約為15～30 min。

2.3 鞘內注射巴氯酚對坐骨神經結扎致神經病理性痛大鼠脊髓背角GAT-1免疫陽性神經元的影響

與NS組比較，鞘內注射0.3μg巴氯酚后1、4 h，大鼠脊髓背角淺層GAT-1免疫陽性染色灰度值明顯降低(P＜0.01，P＜0.05);給藥后8 h，Bac組脊髓背角淺層GAT-1染色灰度雖然降低，但與NS組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Effects of intrathecal injection of baclofen on the expression of GAT-1 in spinal cord of neuropathic rats with chronic constriction injury(×100)

2.4 鞘內注射巴氯酚對坐骨神經結扎致神經病理性痛大鼠脊髓GAT-1蛋白含量的影響 與NS組和給藥前比較，鞘內注射0.3 μg巴氯酚后0.5～4 h，大鼠脊髓節段的GAT-1蛋白含量均明顯降低(P＜0.01，P ＜0.05)，至給藥后 8 h，GAT-1 的表達逐漸增多，與NS組和給藥前相比差異均無統計學意義(P＞0.05)。見Tab 3。

3 討論

目前認為，巴氯酚可激活突觸前GABAB受體使背根節C及Aδ纖維傳入神經動作電位時程縮短，Ca2+電流減小，復極化過程加快，一方面可抑制致痛物質，如P物質、谷氨酸等興奮性氨基酸的釋放;另一方面，巴氯酚可促進抑制疼痛信息傳遞的遞質如GABA、內啡肽的釋放。但目前還不清楚巴氯酚促進GABA釋放的機制。

Tab 1 Effects of intrathecal injection of baclofen on mechanical withdrawl threshold in neuropathic rats with chronic constriction injury(g，ˉ±s，n=8)

Tab 1 Effects of intrathecal injection of baclofen on mechanical withdrawl threshold in neuropathic rats with chronic constriction injury(g，ˉ±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NS group;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs the baseline values

0.5 1 2 4 8 12 24 NS 4.2 ±2.1 5.9 ±2.8 5.1 ±1.2 3.9 ±2.0 4.1 ±2.4 4.Group Baseline Post-injection/h 4 ±1.8 4.2 ±1.2 4.0 ±1.9 Bac1 4.9 ±2.6 13.2 ±2.6＊＊## 12.3 ±3.8＊＊## 8.1 ±3.3＊＊# 4.9 ±1.7 3.2 ±0.8 4.0 ±2.1 3.3 ±2.4 Bac2 4.5 ±1.7 13.5 ±2.3＊＊## 12.9 ±4.5＊＊## 11.4 ±3.2＊＊## 7.1 ±2.2*# 5.2 ±1.1 5.2 ±1.3 4.8 ±1.3 Bac3 4.5 ±1.9 12.3 ±2.2＊＊## 12.4 ±1.8＊＊## 12.8 ±2.0＊＊## 8.3 ±3.5*# 7.8 ±2.7＊＊#5.9 ±1.1 3.8 ±2.2

Tab 2 Effects of intrathecal injection of baclofen on the thermal withdrawl latency in neuropathicrats with chronic constriction injury(s±s，n=8)

Tab 2 Effects of intrathecal injection of baclofen on the thermal withdrawl latency in neuropathicrats with chronic constriction injury(s±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NS group;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs the baseline values

24 NS 6.8 ±2.4 5.2 ±2.2 7.1 ±1.5 6.4 ±2.5 7.3 ±2.7 6.Group Baseline Post-injection/h 0.5 1 2 4 8 12 3 ±1.9 6.8 ±1.3 7.7 ±2.5 Bac1 6.5 ±1.6 18.2 ±4.2＊＊## 11.67 ±3.7＊＊## 9.1 ±1.8*## 6.4 ±2.2 5.7 ±1.5 6.2 ±2.6 6.9 ±2.2 Bac2 7.4 ±1.9 17.5 ±4.0＊＊## 18.2 ±5.3＊＊## 15.9 ±3.8＊＊## 10.9 ±2.8*# 7.0 ±1.8 7.4 ±1.5 6.5 ±1.6 Bac3 7.4 ±2.7 16.8 ±3.7＊＊## 17.9 ±4.8＊＊## 16.6 ±4.2＊＊## 13.6 ±3.3＊＊##10.8 ±2.3＊＊#8.6 ±1.9 6.6 ±3.1

Tab 3 Effects of intrathecal injection of baclofen on the expression of GAT-1 proteinin spinal cord of neuropathic rats with chronic constriction injury(%of Baseline，ˉ ± s，n=4)

Tab 3 Effects of intrathecal injection of baclofen on the expression of GAT-1 proteinin spinal cord of neuropathic rats with chronic constriction injury(%of Baseline，ˉ ± s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs NS group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs the baseline values;##P＜0.01 vs Pre-injection values

Group Baseline Pre-injection Post-injection/h 0.5 1 2 4 8 12 24 NS 100±0 179±29△△ 172±18△△ 165±23△△ 181±35△△ 175±26△△ 168±27△△ 174±25△△ 169±24△△Bac 103±24 182±31△△ 116±17＊＊##95±16＊＊## 107±19＊＊##100±23＊＊## 149±21△ 159±26△ 165±30△

本實驗在坐骨神經結扎致痛覺過敏大鼠鞘內給予巴氯酚，能抑制大鼠的觸誘發痛和熱痛覺過敏，其鎮痛效應的持續時間隨劑量的增加而延長，0.3 μg巴氯酚可提供至少4 h的鎮痛。在本實驗所用的三個劑量中，1.0 μg的巴氯酚雖然鎮痛效應持續時間較其它兩個劑量的作用時間長，但是其對大鼠的運動功能影響較大。在該實驗組中，部分大鼠的運動功能評分≥2，出現了不同程度的自主運動障礙和對足底刺激反應降低，表明大劑量的GABAB受體激動劑對大鼠的運動功能有一定影響，這也是GABAB受體激動劑用于臨床鎮痛受限制的原因之一。

在本實驗中，鞘內給予0.3 μg巴氯酚后，大鼠脊髓背角淺層GAT-1樣免疫陽性染色灰度明顯降低，表明GAT-1的表達明顯減少，且與NS組及給藥前比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。0.3μg巴氯酚使GAT-1表達減少的效應持續至給藥后4 h，至給藥后8 h，脊髓背角淺層GAT-1的表達逐漸升高，但與對照組相比差異無統計學意義，這與該劑量在神經病理性痛大鼠模型上的鎮痛效應持續時間是一致的，提示鞘內注射巴氯酚可能通過調節脊髓水平GAT-1的表達來發揮鎮痛作用。最近有研究發現［9］，GAT可與鈣/鈣調蛋白依賴激酶Ⅱ以及谷氨酸脫羧酶(GAD)形成復合體，共同調節GABA的合成與釋放。Kang等［10］研究證實，在沙土鼠的海馬，GABAB受體的激活可使囊泡GABA轉運體(VGAT)減少，減少突觸前GABA的釋放，增加突觸間隙GABA的含量。因此推測在本實驗中，巴氯酚可能通過激活了突觸前的自身 GABAB受體，使脊髓背角GAT-1的含量降低，減少GABA的重攝取，進而增加突觸間隙GABA的含量，從而抑制疼痛信息的傳遞。

綜上所述，鞘內注射GABAB受體激動劑巴氯酚可減輕坐骨神經結扎致神經病理性痛大鼠的痛覺過敏，其鎮痛作用可能與抑制脊髓水平GABA轉運體-1的表達有關。

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