小鼠核結合因子a1基因啟動子報告載體的構建及鑒定*

鄭 紡 崔 壯 王寶利 王洪武

核結合因子a1（core binding factor a1，Cbfa1）是成骨特異性轉錄激活因子，在成骨細胞發育、分化和骨形成過程中起著至關重要的分子開關作用。鑒于Cbfa1在骨形成過程中的關鍵作用，因此構建Cbfa1基因啟動子報告載體，通過觀察藥物對該啟動子轉錄活性的影響，可以用于促骨形成藥物的篩查及評價。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 小鼠成骨細胞系MC3T3E1、大腸桿菌菌種DH5α為本室保存。質粒表達載體PGL3-Basic、螢光素酶活性測定試劑盒（Luciferase assay system）、β-半乳糖苷酶活性測定試劑盒（β-galactosidase assay kit）和MluI、XhoI限制性內切酶均為Promega公司產品；質粒小量提取試劑盒和DNA提取試劑盒均購自索萊寶公司；Lipofectamine2000為Invitrogen公司產品；DMEM培養基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶均購自GIBCO公司；dNTPs、KOD-plus ver2高保真DNA聚合酶為日本TOYOBO公司產品；T4DNA連接酶、DNA Marker為大連TaKaRa公司產品。引物序列及DNA序列分析由上海英駿生物技術公司合成及測序。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增小鼠Cbfa1基因啟動子區的DNA序列 取正常Balb/c小鼠尾靜脈血5 mL，按照DNA提取試劑盒說明書進行操作，提取基因組DNA。分析小鼠Cbfa1基因的DNA序列，巢式PCR擴增Cbfa1啟動子區-1 000 bp～+200 bp區域的片段。巢式PCR第1輪引物為Cbfa1-out-up：5′-TGCAGAAC TGCACCCAAAGTCCT-3 ′；Cbfa1-out-down：5′-GGCTGTTTG ACGCCATAGTCCCT-3′，擴增片段長度約為1 560 bp。接著以第1輪PCR凝膠純化回收后產物為模板，以Cbfa1-in-XhoI-up：5′-AAAACTCGAGTTAAGATCTTCAAAGTAACCA-3 ′ 和Cbfa1-in-MluI-down：5′-AAAAACGCGTCGGAGTGAGCAAA TATTTGAAGGACCTACTA-3′為引物進行第2輪PCR，擴增Cbfa1啟動子-1 000 bp～+200 bp區域并引入XhoI和MluI酶切位點，凝膠純化回收第2輪PCR產物。兩輪PCR反應條件均為：95 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個循環；72℃終延伸5 min。

1.2.2 小鼠Cbfa1基因啟動子報告載體的構建 XhoI和MluI雙酶切PCR擴增并純化回收的長約1 200 bpCbfa1啟動子DNA片段，同時將螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic行XhoI和MluI雙酶切，回收線性化載體。T4連接酶將兩者定向連接。XhoI和MluI雙酶切并測序鑒定陽性克隆，正確插入的克隆命名為pGL3-Cbfa1報告基因載體。

1.2.3 MC3T3-E1細胞轉染與報告基因分析 使用含10%FBS、100 U/mL青霉素、0.1 g/L鏈霉素的DMEM培養基將MC3T3-E1細胞培養至對數生長期后，用消化液處理細胞，換用含10%FBS無抗生素的DMEM培養基懸浮細胞，按2×105/孔接種至24孔板并隨機分為pGL3-Cbfa1轉染組和pGL3-Basic轉染組，使用lipofectamineTM2000分別將1 μg的重組質粒pGL3-Cbfa1和對照載體pGL3-Basic瞬時轉染至各組MC3T3-E1細胞內，每組設6個復孔，每孔均同時轉染0.1 μg β-半乳糖苷酶質粒作為內參照以校正細胞的轉染效率。轉染48 h后收集細胞，加入冰預冷的細胞裂解液（0.1 mol/L KH2PO4，1 mmol/L二硫蘇糖醇，pH=7.8），液氮凍融3次，4 ℃12 000 r/min離心20 min，收集上清。使用Luciferase assay system測定細胞的螢光素酶活性。相對熒光強度單位由β-galactosidase assay kit測定β-半乳糖苷酶活性做標準參照。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行數據處理。兩組細胞同時檢測，每組細胞重復檢測3次，取平均值作為該組細胞的螢光素酶活性或β半乳糖苷酶活性值。以細胞螢光素酶活性/β-半乳糖苷酶活性比值表示啟動子螢光素酶的相對活性。pGL3-Cbfa1報告載體的活性采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠Cbfa1基因啟動子區的擴增 巢式PCR第1輪擴增片段長度約為1 560 bp，巢式PCR第2輪擴增片段長度約為1 220 bp。見圖1。

2.2 pGL3-Cbfa1重組螢光素酶報告基因載體的酶切鑒定和DNA序列分析 pGL3-Cbfa1重組螢光素酶報告基因載體經MluI和XhoI雙酶切鑒定，得到4 800 bp和1 200 bp兩條片段；pGL3-Basic經MluI和XhoI雙酶切鑒定得到約4 800 bp的線性片段。經序列測定分析，重組報告載體中插入序列完全正確，載體序列與Cbfa1基因啟動子序列正確拼接，見圖2。

2.3 pGL3-Cbfa1重組螢光素酶報告載體的活性檢測 重組報告載體pGL3-Cbfa1螢光素酶活性明顯升高（t=19.795，P<0.001），約為pGL3-Basic的35倍，見圖3。

3 討論

骨質疏松的發生主要是由于成骨細胞的作用弱于破骨細胞的作用引起的，因此要想從根本上達到治療骨質疏松的目的，增強成骨細胞活性、促進骨形成就顯得更為重要。然而目前用于臨床的藥物基本上只能抑制骨丟失，不能促進骨形成，只能在一定程度上延緩疾病的進展，卻不能逆轉業已出現的骨量減少和骨顯微結構的破壞，也就無法治愈骨質疏松。因此要想從根本上治療骨質疏松，尋找能夠增強成骨細胞活性、促進骨形成的藥物至關重要。

Cbfa1是對成骨細胞分化、成熟起關鍵作用的轉錄因子。研究發現，成骨細胞譜系高表達Cbfa1，該基因能促進成骨細胞表達骨鈣素、堿性磷酸酶、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等下游成骨細胞表征分子，誘導多潛能間充質干細胞向成骨細胞表型分化，促進骨小結形成[1-3]。Cbfa1基因敲除的雜合子小鼠出生時骨組織發育明顯受阻，而純合子小鼠出生時無成骨細胞和骨組織形成[4]。研究還發現，骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等局部因子可上調Cbfa1表達[5-6]。因此，包括BMP在內的許多局部因子與轉錄因子Cbfa1的相互作用在成骨細胞發育和骨形成過程中起著十分重要的作用。基于Cbfa1在骨形成過程中發揮的關鍵作用，筆者認為它可以作為分子靶點用于抗骨質疏松藥物的篩選。

為此，本研究進行了Cbfa1啟動子重組報告基因載體的構建，并檢測了該報告載體的轉錄活性。用于構建報告載體的小鼠Cbfa1基因啟動子序列來自基因組DNA的PCR擴增產物，考慮到如果直接擴增這段長約1 200 bp的區域，若恰好在啟動子序列的關鍵元件發生堿基錯配，會大大降低所構建載體的可信度。另外，直接將該片段與螢光素酶報告載體進行連接也不容易操作。因此，筆者采取了巢式PCR策略，通過兩輪PCR反應，使用兩套引物擴增特異性的Cbfa1基因啟動子DNA片段。文中第2對引物的功能是特異擴增位于首輪PCR產物內的一段DNA片段，并分別在兩條引物中引入能夠將Cbfa1啟動子定向克隆入螢光素酶報告載體pGL3-Basic的MluI和XhoI酶切位點。DNA序列分析結果證實整段序列全長無錯配堿基，且拼接的位置和方向正確。接下來，筆者將Cbfa1基因啟動子片段插入不含啟動子的pGL3-Basic載體的多克隆位點，獲得了重組報告基因載體pGL3-Cbfa1。該載體中Cbfa1啟動子序列中含有許多重要的順式作用元件[7]，將它瞬時或穩定轉染細胞后，可通過檢測螢光素酶的表達水平來了解Cbfa1基因的基礎表達和藥物對Cbfa1基因啟動子轉錄活性的影響。研究中，經轉染小鼠成骨細胞系MC3T3-E1，報告基因分析研究發現pGL3-Cbfa1報告載體與對照載體相比顯示出較高的活性，約為pGL3-Basic的35倍，該結果表明所構建的報告載體能夠反映Cbfa1啟動子的活性。本文中pGL3-Cbfa1報告載體的成功構建為借助于Cbfa1啟動子進行抗骨質疏松藥物篩選提供了一個非常好的研究工具，也為進一步建立抗骨質疏松藥物的效果評價方法奠定了基礎。

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