VEGF與b-FGF在海水浸泡大鼠燒傷皮膚組織中的表達

張愛群 孫富國 徐忠華 徐振轅 王昭英 陳錄庭

現代海戰中海水浸泡傷的發生率很高[1]。本研究采用流式細胞儀檢測海水浸泡大鼠皮膚燒傷組織中血管內皮生長因子（VEGF）與堿性成纖維細胞生長因子（b-FGF）的表達，探討兩者在病變發展和恢復過程中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 實驗選用普通級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量（2.681±8.194）g，隨機分成實驗組（海水浸泡）和對照組（生理鹽水浸泡）。每組又分為損傷后2 h和1、3、5、7、14 d 6個時點，每個時點5只大鼠。

1.2 模型制作 每組大鼠均以10%水合氯醛0.7～0.8 mL腹腔內注射，麻醉后1～2 min即實施模型制作。鼠背部褪毛并用酒精燈藍色火焰燒灼局部皮膚7～8 s，造成深Ⅱ度燒傷（病理證實），面積約3 cm×3 cm×4 cm，然后將大鼠分別浸泡于海水或生理鹽水中，2 h后取出，大鼠可自由攝食和飲水。

1.3 標本采集 分別于浸泡后2 h和1、3、5、7、14 d脫頸處死，取燒傷處皮膚組織，70%乙醇固定，4℃冰箱封存約30 d。

1.4 實驗方法

1.4.1 流式細胞儀及檢測參數 采用美國Beckman Coultet公司生產的Epics-XLⅡ型流式細胞儀，激發光源為15 mW氬離子激光器，激光波長為488 nm。

1.4.2 主要試劑 美國圣克魯斯生物公司生產VEGF鼠抗人多克隆抗體（147）：SC-507；b-FGF鼠抗人多克隆抗體（147）：SC-79。

1.4.3 流式細胞懸液制備方法 將固定的組織放在120目不銹鋼網上下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直至將組織搓完為止。將平皿中的混懸液經300目銅網過濾去除細胞團塊，收集細胞懸液，以500～800 r/min離心沉淀2 min。

1.4.4 細胞免疫熒光標記 取單細胞懸液1×106/mL 0.1 mL，加入鼠抗人多克隆抗體工作液0.1 mL，室溫孵育30 min，加入PBS 10 mL洗滌1次，棄上清，加入羊抗鼠熒光素-IgG（FITC-IgG）二抗工作液100 μL，避光、室溫孵育30 min，加入PBS 10 mL離心同上，棄上清以除去未結合的熒光抗體，上機檢測前加入二抗的陽性對照和陰性對照。

1.5 統計學分析 應用SPSS 12.0統計軟件,計量資料以±s表示，同一時點組間比較采用兩獨立樣本資料t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2組大鼠皮膚燒傷組織傷后1～14 d，實驗組VGEF和b-FGF表達均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

3 討論

VEGF與b-FGF是皮膚燒傷創面愈合過程中的2種重要細胞因子。對創面血管增生、肉芽組織形成、膠原纖維合成有重要作用。海水具有高滲、堿性、低溫、有菌等特點，可加重傷口局部及周圍組織的水腫、變性、壞死及炎性反應[2]。海水浸泡傷口，受海水高滲等理化因素的影響，使局部組織微環境及各種生長因子發生變化，導致VEGF與b-FGF升高，兩者與組織創傷的嚴重程度及愈合情況關系密切。

VEGF是一種特異性作用于血管內皮細胞的多功能細胞因子，廣泛表達于成纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞及腫瘤細胞等多種細胞，VEGF特異地與血管內皮細胞上的專一受體血管內皮生長因子受體Ⅰ（FLR-1）或血管內皮生長因子受體Ⅱ（KDR）結合，從而引起內皮細胞增殖及血管通透性增加，其主要功能是促進血管內皮細胞分化增殖，增加微靜脈和小靜脈的通透性[3]，使血漿蛋白滲到血管外形成臨時基質，利于血管形成[4]，在皮膚損傷愈合過程中起重要作用。正常皮膚有多種細胞因子表達，其中VEGF呈低水平表達，主要表達于基底細胞及血管內皮細胞。VEGF的表達受低氧、活化癌基因、生長因子、細胞因子等多種因素的調控[5]，如b-FGF、腫瘤壞死因子（TNF）-α等均可促進VEGF的表達，間接發揮促血管形成的作用。本研究顯示VEGF自損傷后2 h開始升高，損傷后1～14 d實驗組高于對照組，損傷后5d達高峰，較對照組峰值錯后2 d，以后緩慢下降，但仍高于對照組。隨損傷創面的愈合，VEGF逐漸下降，實驗組明顯慢于對照組，VEGF在形成新生血管的同時，也加重組織細胞的脫水，使血栓形成的危險增加。b-FGF即堿性成纖維細胞生長因子，可誘導多種細胞增殖、分化，與創傷愈合密不可分。b-FGF可促進VEGF的生成，發揮促血管生成作用，且具有絲裂原活性，可促進成纖維細胞的生長、增殖，其還具有趨化作用，趨化炎性細胞和組織修復細胞向創面聚集[6]。b-FGF主要存在于表皮細胞、內皮細胞和部分成纖維細胞的胞漿和胞外基質中。對傷口肉芽組織形成、局部血管增生、膠原纖維合成有重要作用，與海水浸泡傷情嚴重程度有關。

表1 VEGF與b-FGF在海水浸泡大鼠皮膚織中不同時間的表達 （n=5，±s）

表1 VEGF與b-FGF在海水浸泡大鼠皮膚織中不同時間的表達 （n=5，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01

指標 組別VEGF b-FGF對照組實驗組t對照組實驗組t 2 h 320.42±40.51 338.89±52.97 0.619 338.38±26.56 395.76±98.17 1.262 1 d 332.05±40.23 397.99±33.16 2.828*389.71±41.38 490.64±66.76 2.874*損傷后時間3 d 414.07±65.19 492.27±34.01 2.378*434.04±29.75 522.66±31.52 4.572**5 d 411.33±33.44 529.49±41.16 4.982**441.20±21.54 534.05±33.90 5.170**7 d 405.44±52.00 498.38±49.09 2.906*434.04±35.56 569.39±53.51 4.711**14 d 349.89±38.20 421.18±49.49 2.550*411.24±19.89 483.68±53.76 2.826*

VEGF與b-FGF在海水浸泡大鼠皮膚燒傷局部組織表達增高，與細胞缺血、缺氧、損傷程度及范圍有密切關系，對判斷海水浸泡傷情及預后具有一定參考價值，臨床救治過程中應密切注意血液濃縮等情況的改變，防止血栓形成的發生。

[1]沈宏亮,王強,錢方,等.左氧氟沙星殼聚糖緩釋微球對海水浸泡創傷的初期治療效果[J].外科理論與實踐,2006,31（3）:262-264.

[2]蔣建新,王正國,尹志勇.戰創傷研究進展[J].人民軍醫,2007,50（1）:22-24.

[3]李菲菲,米立國,隋鴻錦.血管內皮生長因子對皮膚血管生成影響的研究進展[J].大連醫科大學學報，2009,31（5）：599-603.

[4]劉霞,高峰.創傷愈合的分子機制研究進展[J].醫學綜述，2005，11（3）:199-202.

[5]毛光華，韓存芝，張俊萍，等.血清中VEGF，VEGFR1與VEGFR2在肺癌中的表達及其相互關系[J].中國現代藥物應用，2009,3（22）：1-2.