選擇性氧化形成三對二硫鍵合成齊考諾肽*

曹本文, 王衛國, 李戰雄, 徐紅巖

(1. 蘇州大學 紡織與服裝工程學院,江蘇 蘇州 215021;2. 中國科學院 上海有機化學研究所,上海 200032)

新藥齊考諾肽(1)能治療與創傷、腫瘤和神經痛等相關的慢性疼痛及對阿片類藥物不敏感的難治性疼痛[1]。1為環形肽，含有三對二硫鍵,其25個氨基酸序列為:Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys，其肽鏈結構中二硫鍵的連接模式為Cys1-Cys16, Cys8-Cys20, Cys15-Cys25[2]。

作為一種含有二硫鍵的多肽，分子結構中二硫鍵的準確形成是合成1的關鍵技術[3]。通過巰基氧化形成多肽分子結構中的二硫鍵時，僅僅含一對二硫鍵時比較容易選擇反應條件，如通過空氣,I2, H2O2,汞鹽等氧化[4]。但是，1氧化形成三對二硫鍵的情況比較復雜，反應會形成多種異構體，因此需選擇合適的氧化方法—─即選擇性氧化[5]。

本文利用不同巰基保護基的氧化反應性差異，分別以空氣和碘作氧化劑，通過選擇性氧化使齊考諾肽線性肽(2)的1,8,16,20-位兩對Trt保護巰基先形成兩對二硫鍵，制得含兩對二硫鍵的齊考諾肽(3);3經碘氧化15,25-位Acm保護的巰基，成功地生成第三對二硫鍵合成了1(Scheme 1)。氧化反應過程用MS和HPLC監測。

Scheme1

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

S HIMADZU LCMS-2020型質譜儀;Shimadzu LC-10AT型高效液相色譜儀(HPLC, SPD-10A VP紫外可變波長檢測器,日本LC-10ATVP泵);多肽合成反應柱，玻璃材質，定制;瑞江RJ-TDL-40B低速臺式離心機。

保護氨基酸：Fmoc-Cys(trt)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH; 1-羥基苯并三氮唑(HOBt), 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU),二異丙基乙胺(DIEA), Fmoc-Linker-MBHA-Resin樹脂,吉爾生化(上海)有限公司;二氯甲烷(DCM),乙二硫醇(EDT),對甲苯酚,苯甲硫醚,吡啶,三氟乙酸(TFA),茚三酮,苯酚,乙醚,碘,硫代硫酸鈉,二甲基甲酰胺(DMF),乙腈,分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 1的固相合成[6～8]

(1) 樹脂的連接

在多肽合成反應柱中加入Fmoc-Linker-MBHA-Resin樹脂1 g(0.28 mmol·L-1),用DCM溶脹，抽干，加入20%(體積分數,下同)吡啶/DMF溶液,振蕩反應20 min。脫除Fmoc基團，用DMF洗滌9遍，抽干。加入Fmoc-Cys(trt)-OH 320 mg的DMF(10 mL)溶液,TBTU 217 mg, HOBT 85 mg和DIEA 0.17 mL，氮氣振蕩反應1 h。用DMF洗滌樹脂除去多余的Fmoc-Cys(trt)-OH制得連接樹脂。

(2) 線性肽鏈的合成

脫除Fmoc保護基：向裝有連接樹脂的反應柱中加入20%吡啶/DMF溶液10 mL，振蕩反應20 min。抽干，用DMF沖洗樹脂9遍。

形成肽鍵：向反應柱中加入定量的保護氨基酸(用DMF 10 mL溶解，加入定量的TBTU和DIEA),氮氣振蕩反應1 h。抽干，用DMF洗滌6遍。

肽鏈延長：將前一步合成的樹脂肽作為下一步合成的氨基組分，重復上述接肽過程，進行25次接肽反應制得樹脂線性肽鏈。

檢測反應進程：用茚三酮顯色法定性檢測反應進程，判斷各步接肽的終點。第一步脫除Fmoc保護基中若樹脂肽呈藍色，表明Fmoc保護基已脫除。第二步形成肽鍵步驟中若樹脂肽呈藍色，表明反應不完全，需再次縮合。當樹脂肽呈無色透明狀，表示縮合反應已完成。

(3) 樹脂線性肽鏈的切割

在單口燒瓶中加入干燥的樹脂線性肽鏈,TFA 16.5 mL, EDT 1 mL,對甲苯酚1 mL,苯甲硫醚0.5 mL和水1 mL,攪拌下于20 ℃反應2 h。抽濾，濾餅用少量TFA洗滌2次，洗液與濾液合并，用無水乙醚(5倍～10倍量)析晶，離心分離，沉淀用少量無水乙醚洗滌，真空干燥得2粗肽。

(4)2的分離純化[9]

HPLC純化條件：21.4 mm×250 mm C18柱，粒徑5 μm，檢測波220 nm。洗脫液A： 0.1%TFA水溶液；洗脫液B： 0.1%TFA乙腈溶液；選擇洗脫梯度10%～100%，洗脫時間15 min，流速1 mL·min-1。2粗肽經HPLC純化制得2，分子量2 787.18，純度91%(HPLC，下同); MSm/z: 558.20{[M+5H]5+}, 697.50{[M+4H]4+}, 929.75{[M+3H]3+}。

1.3 1的合成

(1) 第一步氧化形成兩對二硫鍵[10～15]

在燒杯中加入2，純水100 mL，用氨水調至pH 8左右,攪拌下于室溫反應24 h。濃縮制得3粗肽，經HPLC純化制得3，分子量2 784.18，純度95%; MSm/z: 557.60{[M+5H]5+}, 696.55{[M+4H]4+}, 929.10{[M+3H]3+}。

(2) 第二步氧化形成第三對二硫鍵[16～21]

在單口燒瓶中加入純肽，25%甲醇溶液和碘8 eq,攪拌下于室溫反應2 h。滴加硫代硫酸鈉至溶液無色，濃縮制得1粗肽，經HPLC純化制得1，分子量2 639.18，純度95%; MSm/z: 528.80{[M+5H]5+}, 660.70{[M+4H]4+}, 880.55{[M+3H]3+}。

2 結論

對齊考諾肽線性肽采用Fmoc保護合成策略，使用TBTU/HOBT/DIEA作為肽的縮合劑，先用Trt保護1，8，16，20-位的兩對巰基。第一步采用空氣氧化法氧化形成兩對二硫鍵，氧化條件溫和，得率(34%)較高。第二步用碘氧化15，25-位用Acm保護的巰基形成第三對二硫鍵，經HPLC分離成功地得到齊考諾肽，純度95%。

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