機械牽張誘導THP-1細胞高遷移率族蛋白B1移位出核*

丁 寧， 肖 慧， 許立新， 佘守章

(廣州市第一人民醫院1麻醉科和麻醉學實驗室，2門診部，廣東 廣州 510180)

機械牽張誘導THP-1細胞高遷移率族蛋白B1移位出核*

丁 寧1△， 肖 慧2， 許立新1， 佘守章1

(廣州市第一人民醫院1麻醉科和麻醉學實驗室，2門診部，廣東 廣州 510180)

目的探討機械牽張對高遷移率族蛋白B1(HMGB1)在THP-1細胞內移位的影響。方法構建HMGB1-增強型綠色熒光蛋白(EGFP)融合蛋白的真核表達載體。通過兩步亞克隆的方法，將HMGB1和EGFP的編碼序列以融合蛋白的形式克隆到pcDNA3-HA載體上，隨后轉染THP-1細胞并施加機械牽張應變，熒光顯微鏡觀察HMGB1在細胞內的表達及移位情況。結果重組質粒經酶切鑒定證明構建正確，并在THP-1細胞中大量表達。熒光顯微鏡觀察發現，HMGB1-EGFP融合蛋白主要分布于細胞核，經機械牽張18 h，可見細胞中融合蛋白從細胞核移位到細胞質，在細胞漿中觀察到明顯的綠色熒光。結論成功構建了HMGB1-EGFP融合蛋白，在THP-1細胞中觀察到機械牽張可誘導HMGB1移位出核。

機械牽張； 高遷移率族蛋白質類； THP-1細胞

呼吸機所致肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)是危重病人進行機械通氣支持治療時常見而嚴重的并發癥，其本質是由機械牽張所引起的肺內炎癥介質過度釋放，引起或加重肺損傷[1-3]。我們研究發現，高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein, HMGB1)作為關鍵性“晚期”炎癥介質，在VILI的發病過程中發揮重要作用[4,5]，并利用熒光素酶報告基因載體系統發現機械牽張對HMGB1蛋白的激活作用發生于轉錄水平[6]。為了進一步證實HMGB1在VILI中的作用及其在細胞內的定位與移位機制，我們構建了HMGB1的增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)融合表達載體，通過綠色熒光蛋白示蹤技術，觀察其在機械牽張誘導下的細胞內定位和移位情況。

材 料 和 方 法

1材料

質粒pEGFP-C2購自Clontech， pcDNA3-HA、pET14b-EGFP和THP-1細胞系由本室保存，pGEX-4T-HMGB1由日本Kimitoshi Kohno博士惠贈。PolyFect轉染試劑購自Qiagen，DAPI染色試劑購自Molecular Probes，DMEM培養基購自Gibco-BRL，胎牛血清fetal bovine serum，FBS購自HyClone，質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自U-gene，限制性核酸內切酶KpnI、EcoR I、XhoI、BamH I、T4 DNA連接酶、高保真DNA聚合酶KOD plus和堿性磷酸酶購自ToYoBo，引物由北京賽百盛公司合成。

2方法

2.1HMGB1-EGFP真核表達載體的構建 設計分別含KpnI酶切位點的上、下游引物，上游引物為5'-cat ggt acc ggc aaa gga gat cct aag aag c-3'， 下游引物為5'- cat ggt acc ttc atc atc atc atc ttc ttc ttc at-3'，從pGEX-4T-HMGB1質粒上擴增HMGB1編碼序列，PCR反應條件為94 ℃ 15 s，53 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共35個循環，瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物。對質粒pET14b-EGFP行KpnI酶切并回收產物。二者以T4 DNA連接酶在16 ℃過夜連接，反應產物轉化DH5α感受態菌并接種于LB瓊脂培養板，37 ℃、5% CO2孵箱培養12 h。挑取單菌落接種于LB培養基37 ℃振搖過夜，提取質粒后行PCR、BamH I酶切和測序鑒定，構建的質粒命名為pET14b-HMGB1-EGFP。

分別設計含EcoRI和XhoI酶切位點的上、下游引物，上游引物為5'-cat ggt acc ggc aaa gga gat cct aag aag c-3'，下游引物為5'-cat ggt acc ttc atc atc atc atc ttc ttc ttc at-3'，從載體pET14b-HMGB1-EGFP上擴增融合的HMGB1-EGFP編碼序列。PCR反應條件為94 ℃ 15 s，53 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，共35個循環。用EcoR I和XhoI分別對PCR產物和真核表達載體pcDNA3-HA進行雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產物，T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。反應產物轉化DH5α感受態菌并接種于LB瓊脂培養板,37 ℃、5 % CO2孵箱培養12 h。挑取單菌落接種于LB培養基37 ℃振搖過夜。提取質粒后行PCR、EcoR I和XhoI酶切及測序鑒定，構建的真核表達質粒命名為pcDNA3-HMGB1-EGFP。

2.2脂質體介導的瞬時轉染 THP-1細胞培養于含10 % FBS、0.1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM中，置于37 ℃、5 % CO2孵箱傳代培養。轉染前24 h將細胞鋪于Bioflex板，待細胞至約70 %融合時，加入0.4 μg質粒DNA和3 μg PolyFect轉染試劑混勻，室溫孵育10 min。在DNA轉染復合物中加入含10 % FBS的DMEM培養基，置于37 ℃、5 % CO2孵箱繼續培養。

2.3實驗分組及機械牽張 實驗分組：(1) pEGFP轉染對照組；(2) pcDNA3-HMGB1-EGFP轉染組；(3) pcDNA3-HMGB1-EGFP轉染+機械牽張組，應用Flexercell 4000T應變加載系統給予THP-1細胞加載牽張應變，應變幅度設為20%，牽張頻率設為30次/min，機械牽張組在細胞轉染后24 h于含有10 % FBS的新鮮DMEM按不同刺激時間(1 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、36 h和48 h)繼續培養，上述實驗重復3次。

2.4熒光顯微鏡觀察 細胞以PBS洗滌后，用4 %多聚甲醛固定15 min。PBS洗滌3次后用0.1%硼氫化鈉處理5 min，PBS再次洗滌3次，以100 μg/L的DAPI染核5 min，PBS洗滌、封片后分別利用熒光顯微鏡(Leica)的A4和L5濾光片進行觀察并拍照。

結 果

1質粒pET14b-HMGB1-EGFP的鑒定

PCR擴增產物電泳可見約650 bp的片段，與插入的DNA大小相符。BamH I單酶切產物電泳可見約5 kb和1.2 kb 2個條帶，表明單點插入方向正確。測序結果也表明質粒構建正確，見圖1。

Figure 1. Identification of recombinant vector pET14-HMGB1-EGFP. M: 1 kb DNA marker; 1: PCR product; 2: pET14-HMGB1-EGFP digested by BamH I.

2質粒pcDNA3-HMGB1-EGFP的鑒定

PCR擴增產物電泳可見約1.4 kb的片段，與插入的DNA序列大小相符。EcoR I和XhoI雙酶切鑒定產物電泳可見5.4 kb和1.4 kb 2個條帶，其中1條與pcDNA3-HA原質粒雙酶切產物電泳結果一致，另1條與PCR產物大小一致，見圖2。

Figure 2. Identification of recombinant vector pcDNA3-HMGB1-EGFP. M: 1 kb DNA marker; 1: PCR product; 2: pcDNA3-HMGB1-EGFP digested by EcoR I and Xho I; 3: pcDNA3-HA digested by EcoR I and Xho I.

3機械牽張對HMGB1-EGFP融合蛋白在細胞中定位的影響

單純轉染pEGFP后綠色熒光均勻分布于整個細胞(圖3A-D)；HMGB1-EGFP轉染則見到綠色熒光定位于細胞核(圖3E-H)；HMGB1-EGFP轉染18 h后，綠色熒光仍然主要定位于細胞核(圖3M-P)，而HMGB1-EGFP轉染并施加機械牽張18 h后，細胞核內熒光蛋白明顯向細胞質移位(圖3I-L)，而在1 h-12 h內未見移位現象。

Figure 3. Expression and localization of HMGB1-EGFP fusion protein in THP-1 cells. A-D: THP-1 cells transfected with pEGFP; E-H: THP-1 cells transfected with HMGB1-EGFP and cultured for 6 h; I-L: THP-1 cells transfected with HMGB1-EGFP and subject to mechanical stretch for 18 h; M-P: THP-1 cells transfected with HMGB1-EGFP and cultured for 18 h; A, E, I, G: bright-field images; B, F, J, N: EGFP-immunofluorescent images; C, G, K, O: nuclei labeled with DAPI; D, H, L, P: merge of EGFP and DAPI. Bar: 20 μm.

討 論

HMGB1是HMG蛋白超家族成員之一，因其分子量小、聚丙烯酰胺凝膠電泳時快速遷移而得名[7]。HMGB1在細胞內外均有分布：在細胞核內，它與DNA結合，發揮維持核小體穩定、調控基因復制、重組和轉錄等重要作用；分泌到胞質或胞外則具有誘導細胞分化、產生趨化作用、作為重要的炎癥因子參與機體炎癥反應等重要作用[8,9]。HMGB1分泌到細胞外的途徑有2種：細胞壞死后被動釋放和在外界刺激因素的作用下主動分泌。既往研究表明，HMGB1在脂多糖的作用下，可以由細胞核分泌到胞外，作為"晚期"炎癥介質參與膿毒癥的發病過程[10]。

機械通氣產生的牽張應變可誘導肺內炎癥介質大量表達和釋放，進而引起或加重肺損傷。最近一項動物實驗發現，大潮氣量通氣(VT=30 mL/kg)組家兔支氣管肺泡灌洗液中HMGB1水平是小潮氣量通氣(VT=8 mL/kg)組的5倍，而給予抗HMGB1抗體預處理則明顯減輕大潮氣量通氣引起的肺微血管通透性增加，并顯著減少TNF-α的產生[11]。我們前期研究發現，機械牽張可以顯著增加HMGB1在mRNA和蛋白水平的表達[3,4,12]。

為了進一步探索HMGB1在VILI中的作用及其機制，本研究構建了HMGB1-EGFP融合表達載體，在細胞中表達帶熒光標記的HMGB1，通過熒光顯微鏡檢測機械牽張時HMGB1蛋白的功能和行為。結果發現，未施加機械牽張時HMGB1蛋白定位在細胞核內。機械牽張細胞18 h后，細胞質中也觀察到綠色熒光，而未牽張組沒有變化，說明細胞核中的綠色熒光蛋白在受到機械牽張后向胞漿移位。在機械牽張的12 h內未觀察到移位現象，而機械牽張36 h后仍然在細胞質中觀察到明顯的綠色熒光，說明HMGB1蛋白的移位反應在時間上是延遲的，直觀地證實了HMGB1作為“晚期”炎癥介質參與VILI的發生發展。

Bonaldi等[13]研究表明，HMGB1在發生乙酰化修飾狀態下才能移位出核，結合我們前期研究的發現，機械牽張可顯著激活p38 MAPK信號通路，推測HMGB1出核的分子機制可能是細胞在受到機械牽張刺激后，p38 MAPK被磷酸化激活，磷酸化的p38 MAPK移位入核，通過直接或間接激活HMGB1乙酰化或抑制其去乙酰化，從而引發HMGB1的主動出核過程。然而，HMGB1釋放及其發揮生物學功能普遍延遲的機制目前尚未闡明，這可能與其在細胞內信號轉導過程的特點密切相關。本文中HMGB1-EGFP真核細胞表達載體的成功構建，為我們進一步深入研究HMGB1的相關生物學功能提供了可靠、有力的工具。

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Mechanicalstretchinducestranslocationofhigh-mobilitygroupbox1proteininTHP-1cells

DING Ning1, XIAO Hui2, XU Li-xin1, SHE Shou-zhang1

(1DepartmentofAnesthesiologyandAnesthesiologyLaboratory,2DepartmentofOut-patient,GuangzhouFirstMunicipalPeople'sHospital,Guangzhou510180,China.E-mail:dingninggy@hotmail.com)

AIM: To investigate the translocation of high-mobility group box 1 protein(HMGB1) in THP-1 cells induced by mechanical stretch.METHODSThe vector that expressed the fusion protein of HMGB1 and enhanced green fluorescent protein(EGFP) was constructed. The cDNA of HMGB1 and EGFP was subcloned into hemagglutinin(HA)-tagged vector pcDNA3-HA by two-step method. THP-1 cells were transfected with pcDNA3-HMGB1-EGFP and exposed to cyclic mechanical stretch at 20 % elongation using Flexercell 4000T cell stretching unit. The translocation of HMGB1 in THP-1 cells was observed under fluorescence microscope.RESULTSThe recombinant plasmid was verified by enzyme digestion. The green fluorescence accumulated in the nuclei of the cells, indicating that the fusion protein was highly expressed in THP-1 cells and localized in the nuclei. Eighteen hours after mechanical stretch, the green fluorescence was observed in the cytoplasm. At the same time, the green fluorescence was still localized in the nuclei of the control cells treated without mechanical stretch.CONCLUSIONThe HMGB1-EGFP fusion protein is successfully and effectively expressed in THP-1 cells. Mechanical stretch induces the translocation of HMGB1 protein from nucleus to cytoplasm.

Mechanical stretch; High-mobility group proteins; THP-1 cells

R329.2； R563

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-033

1000-4718(2011)02-0382-04

2010-06-08

2010-11-05

廣東省科技計劃資助項目(No.2010B031600011)；廣東省醫學科研基金資助項目(No.A2009497)；廣州市醫藥衛生科技一般引導項目(No.2009-YB-021)；廣州市醫藥衛生科技重點資助項目(No.2008-ZDi-14)

△通訊作者 Tel: 020-81048310; E-mail: dingninggy@hotmail.com