晚期缺血預(yù)適應(yīng)促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá),減輕腎臟缺血再灌注損傷*

徐夏蓮， 蔣素華， 許迅輝， 劉 紅， 丁小強(qiáng)

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200032)

晚期缺血預(yù)適應(yīng)促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá),減輕腎臟缺血再灌注損傷*

徐夏蓮， 蔣素華， 許迅輝， 劉 紅， 丁小強(qiáng)△

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200032)

目的探討晚期缺血預(yù)適應(yīng)對腎臟缺血再灌注損傷的作用，以及低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)在其中的作用。方法將雄性C57/BL6N小鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(sham)、缺血再灌注組(IR)和缺血預(yù)適應(yīng)組(IPC)。采用夾閉雙側(cè)腎蒂30 min后恢復(fù)灌注的方法建立腎缺血再灌注小鼠模型；缺血預(yù)適應(yīng)組4 d前給予腎臟15 min預(yù)缺血。觀察缺血預(yù)處理對再灌注后不同時點血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、腎組織形態(tài)學(xué)和細(xì)胞凋亡的影響。采用免疫組化及Western印跡法，分析HIF-1α在腎組織的表達(dá)；采用實時定量RT-PCR法，檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子-1(Glut-1)的mRNA表達(dá)。結(jié)果再灌注24 h后，IPC組小管間質(zhì)損傷程度較IR組顯著減輕，Scr、BUN水平以及小管上皮細(xì)胞凋亡明顯下降。IPC組的HIF-1α核內(nèi)表達(dá)顯著高于IR組，且HIF-1下游靶基因VEGF和Glut-1的mRNA表達(dá)亦顯著增加。結(jié)論晚期缺血預(yù)適應(yīng)能夠顯著改善缺血再灌注后腎臟的形態(tài)和功能，這種保護(hù)作用可能與促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子高表達(dá)有關(guān)。

腎； 缺血預(yù)處理； 缺血再灌注； 低氧誘導(dǎo)因子

急性腎損傷臨床常見，缺血是引起急性腎損傷的重要因素[1]。缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning, IPC)是指預(yù)先短暫的缺血性刺激可使臟器對隨后長時間的缺血產(chǎn)生耐受，它能系統(tǒng)而全面地調(diào)動機(jī)體的保護(hù)反應(yīng)。在其它器官研究中發(fā)現(xiàn)，IPC具有雙相保護(hù)作用，與早期缺血預(yù)適應(yīng)相比，晚期缺血預(yù)適應(yīng)需要合成新的蛋白質(zhì)，保護(hù)效應(yīng)在預(yù)缺血后12-24 h出現(xiàn)，可以持續(xù)數(shù)天到數(shù)周，作用持久而穩(wěn)定[2-4]。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor, HIF)是維持氧自穩(wěn)平衡的核心調(diào)控因子，以往研究發(fā)現(xiàn)，HIF高表達(dá)在心、腦等臟器的缺血預(yù)適應(yīng)中起重要作用[5, 6]，而在腎臟IPC中的作用尚不清楚。本研究通過構(gòu)建小鼠腎臟晚期缺血預(yù)適應(yīng)模型，旨在探討晚期缺血預(yù)處理是否通過穩(wěn)定HIF高表達(dá)從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1材料

Ⅰ抗為兔抗小鼠HIF-1α多克隆抗體(Abcam)，DAB顯色試劑盒(Sigma)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜(Sigma)，ECL Plus 試劑盒(中國碧云天生物公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白質(zhì)定量試劑盒(中國康成生物公司)，Trizol reagent(Invitrogen)，SYBR PrimeScript RT-PCR 試劑盒(Invitrogen)，引物由上海生工合成。

2方法

2.1動物分組與動物模型建立 雄性C57BL/6N小鼠，22-26 g(SPF級，中國科學(xué)院上海實驗動物中心)，隨機(jī)分為3組：(1)假手術(shù)組(sham)，只分離兩側(cè)腎蒂，不進(jìn)行夾閉；(2)缺血再灌注組(IR)，用無損傷動脈夾持續(xù)夾閉兩側(cè)腎蒂30 min，然后恢復(fù)灌注；(3)缺血預(yù)處理組(IPC)，第0 d夾閉兩側(cè)腎蒂15 min，造成預(yù)缺血，間隔4 d后，再次缺血30 min，然后恢復(fù)灌注。再灌注后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、1周和2周處死大鼠(每個時點n= 6)。

2.2腎功能和腎臟組織形態(tài)學(xué)檢測

① 腎功能檢測 眶下靜脈叢采血，分離血清，使用日立全自動生化分析儀酶法測定小鼠尿素氮和肌酐濃度。

② 腎組織病理學(xué)檢查 10%中性甲醛固定腎組織，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為4 μm)后，過碘酸-雪夫氏染色(periodic acid schiff, PAS)染色分析。急性腎小管間質(zhì)損傷程度分級根據(jù)盲法原則由腎臟病理醫(yī)師完成，每個標(biāo)本在200倍光鏡下隨機(jī)選取外髓質(zhì)部10個不重疊視野，正常為0分，受損腎小管間質(zhì) < 25%為1分，25%-50%為2分，50%-75%為3分，>75%為4分，以此作半定量分析并計算其均值，評分值越高代表損傷程度越重。

2.3細(xì)胞凋亡的檢測 采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL法)，檢測細(xì)胞凋亡，按照試劑盒(Roche)說明書進(jìn)行操作。每一切片隨機(jī)選取10個視野，在200倍光鏡下，盲法觀察染色陽性細(xì)胞數(shù)。

2.4免疫組織化學(xué) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育10 min，浸入檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)20 min，正常山羊血清封閉20 min，滴加兔抗小鼠HIF-1α多克隆抗體(1∶50)，4 ℃孵育過夜。PBS漂洗后滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，37 ℃溫箱孵育10 min，PBS漂洗。滴加ABC復(fù)合物，室溫下孵育10 min，PBS漂洗；DAB顯色；蘇木素襯染，脫水，透明，封片。采PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。每張切片隨機(jī)選取10個不重疊視野，應(yīng)用Leica 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2.5Western blotting檢測 組織核蛋白的提取參照試劑盒(Active Motif)的操作步驟進(jìn)行。BCA法測定蛋白濃度，60-80 μg蛋白上樣，行PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉后，兔抗小鼠HIF-1α多克隆抗體(1∶500稀釋)或兔抗小鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體(1∶5 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔lgG(1∶5 000稀釋，Jackson)作為Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h，最后曝光、顯影、成像。應(yīng)用圖像分析軟件對特異性條帶進(jìn)行吸光度分析。

2.6VEGF和Glut-1的mRNA檢測(實時定量RT-PCR) 總RNA提取按Trizol reagent 說明書操作，cDNA的合成參照逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa)操作程序進(jìn)行。以1 μL cDNA 為模板，應(yīng)用SYBR green 試劑盒，在Bio-Rad iQ5 real-time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán),72 ℃ 30 s，每次循環(huán)后于87 ℃收集熒光信號。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線檢測特異性。目的基因擴(kuò)增的Ct值根據(jù)相應(yīng)標(biāo)本中內(nèi)參β-actin的表達(dá)量進(jìn)行均一化計算。引物序列見表1。

表1 各引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1IPC對小鼠存活率、腎功能和腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響

IR組小鼠存活率僅為57%，死亡集中于再灌注后48-72 h；IPC組和sham 組小鼠在整個實驗過程中全部存活。與sham組相比，IR組血肌酐和尿素氮明顯升高，再灌注后24 h達(dá)高峰，以后腎功能逐漸恢復(fù)；再灌注后2 h-2周，IPC組血肌酐均較IR組明顯降低(P<0.05)，見圖1。

PAS染色顯示，IR組小鼠腎臟病理損傷明顯，受損較重的部位集中于皮髓交界和外髓的近端小管，主要表現(xiàn)為小管上皮細(xì)胞死亡脫落，管腔擴(kuò)張，間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤，腎小球無明顯改變。IPC組小鼠腎臟只表現(xiàn)為少量的亞致死性損傷，如小管上皮刷狀緣部分脫落和輕度的間質(zhì)水腫，偶有細(xì)胞壞死，小管間質(zhì)損傷評分較IR組顯著改善(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. The effect of IPC on renal function at different time following reperfusion.±s. n=6. *P<0.05,**P<0.01 vs IR group.

Figure 2. The effect of IPC on renal morphology(PAS staining,×200). 2h, 24h and 1 week following reperfusion, severe tubular dilation, tubular swelling and necrosis, casts and hemorrhage are present in the kidneys of mice subjected to IR, but these changes are drastically attenuated in mice subjected to IR injury after preconditioning. The score of outer medullary area for the histologic appearance and was significantly decreased in delayed IPC group mice compared with that in IP group mice.±s. n=6.**P<0.01 vs IR group.

2IPC對再灌注后腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

再灌注后24 h，IR組小鼠出現(xiàn)明顯的腎小管上皮細(xì)胞凋亡(TUNEL陽性)，凋亡細(xì)胞主要集中在皮髓交界和外髓質(zhì)，腎小球內(nèi)凋亡細(xì)胞較少。IPC組小鼠腎臟TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較IR組明顯減少[(12.3±1.5)/高倍視野(high power field, HPF)vs(38.2±2.0)/HPF)P<0.01],見圖3。

Figure 3. The effect of IPC on tubular cell apoptosis(TUNEL,×200). 6 h and 24 h following reperfusion, the number of TUNEL positive cell in renal outer medulla of IR group mice more than that in IPC group mice. The number of TUNEL positive cells in outer medulla was counted in IR group mice and delayed IPC group mice.±s. n=6. **P<0.01 vs IR group.

3IPC對再灌注后HIF-1α表達(dá)和分布的影響

如圖4的Western blotting結(jié)果所示，與sham組相比，IR組和IPC組腎臟HIF-1α表達(dá)從再灌注后2 h就開始增加，24 h達(dá)高峰，缺血預(yù)處理組HIF-1α高水平表達(dá)持續(xù)到再灌注后48 h，且再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和1周腎臟HIF-1α的蛋白表達(dá)量均顯著高于單純IR組，差異顯著(P<0.01)。如圖5免疫組織化學(xué)結(jié)果所示，sham組HIF-1α陽性細(xì)胞較少；IR組HIF-1α陽性細(xì)胞在內(nèi)髓質(zhì)集合管分布較多，其次沿皮髓交界和外髓質(zhì)壞死小管周圍的殘存細(xì)胞分布；經(jīng)15 min缺血預(yù)處理后，IPC組HIF-1α在上述部位上皮細(xì)胞的胞漿、核內(nèi)表達(dá)均進(jìn)一步增強(qiáng)。

4IPC對HIF-1α靶基因VEGF和Glut-1表達(dá)的影響

IPC組腎臟VEGF mRNA表達(dá)從再灌注后12 h出現(xiàn)明顯升高，48 h達(dá)到高峰，并以較高水平持續(xù)至再灌注后1周，再灌注后12 h、24 h、48 h、72 h和1周腎臟VEGF mRNA表達(dá)量均高于單純IR組(P<0.05)。IPC組腎臟Glut-1 mRNA表達(dá)從再灌注后6 h逐漸升高，72 h達(dá)到高峰，以后逐漸減少但仍維持于較高水平，再灌注后12 h、24 h、48 h、72 h、1周和2周腎臟Glut-1 mRNA表達(dá)量均高于單純IR組(P<0.05)，見圖6。

Figure 4. The effect of IPC on HIF-1α expression following reperfusion(Western blotting analysis).±s. n=6.**P<0.01 vs IR group.

Figure 5. Expression and location of HIF-1α at 24 h following reperfusion in each group(immunohistochemistry,×200).

Figure 6. The effect of IPC on mRNA expression of VEGF and Glut-1 following reperfusion.±s.n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs IR group.

討 論

本研究采用持續(xù)夾閉兩側(cè)腎蒂30 min然后恢復(fù)灌注的方法建立腎臟IR模型，發(fā)現(xiàn)再灌注后腎臟出現(xiàn)明顯的病理性損傷，表現(xiàn)為大量小管上皮細(xì)胞死亡脫落，填塞管腔，管型形成，腎小管變形，間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤；與腎臟形態(tài)學(xué)變化相伴隨的是腎功能急劇下降，小鼠存活率下降至57%，這與既往報道一致，說明腎臟IR損傷的模型構(gòu)建成功[7]。相反，4 d前如果給予短時間缺血預(yù)處理，上述情況全部明顯改善，表現(xiàn)為IPC組腎小管間質(zhì)損傷明顯減輕，腎功能顯著改善且較早恢復(fù)至正常水平，小鼠存活率升高至100%。目前研究證實，細(xì)胞凋亡是急性缺血性腎衰竭時腎小管上皮細(xì)胞死亡的重要形式[8]。本實驗結(jié)果亦顯示，IR組小鼠出現(xiàn)較多的腎小管細(xì)胞凋亡，而IPC組小管細(xì)胞凋亡較IR組明顯減少，說明短時間缺血預(yù)處理能顯著增加細(xì)胞活性和耐缺血缺氧能力，但其機(jī)制尚不清楚。

缺氧是器官缺血再灌注損傷發(fā)生過程中的最早環(huán)節(jié)和關(guān)鍵因素，而低氧誘導(dǎo)因子(HIF)在細(xì)胞氧自穩(wěn)調(diào)節(jié)中起重要作用。近年來，HIF在缺血預(yù)適應(yīng)中的作用逐漸受到重視。本實驗發(fā)現(xiàn)，腎臟晚期缺血預(yù)適應(yīng)后HIF-1α表達(dá)明顯增加：IPC組腎臟HIF-1α表達(dá)從再灌注后2 h就開始增加，24 h達(dá)高峰，以后逐漸減少，但仍維持于較高水平，其表達(dá)規(guī)律與缺血預(yù)處理的腎功能保護(hù)時間規(guī)律較一致；且免疫組化亦顯示IPC組HIF-1α陽性細(xì)胞和分布范圍較IR組明顯增加；IPC組HIF-1α靶基因VEGF和Glut-1mRNA表達(dá)的增加進(jìn)一步驗證了上述實驗結(jié)果。既往我們研究發(fā)現(xiàn)，利用CoCl2或8%低氧預(yù)處理激活HIF-1α可以有效減輕腎臟缺血再灌注損傷[9]。其他研究者發(fā)現(xiàn)給予脯氨酸羥化酶抑制劑或CO等預(yù)處理激活HIF-1α同樣對腎臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[10, 11]。提示短時間預(yù)缺血可能通過激活HIF-1發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。HIF-1調(diào)控包括VEGF和Glut-1在內(nèi)的多種低氧應(yīng)答基因的表達(dá)，這些基因產(chǎn)物或能增加缺氧組織的氧供和運(yùn)輸能力，或能降低細(xì)胞耗氧量，從而緩解器官氧供求之間的矛盾以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，使機(jī)體對缺血缺氧產(chǎn)生耐受和適應(yīng)[12, 13]。單純?nèi)毖俟嘧⒑螅琀IF-1α和靶基因的表達(dá)均有所上調(diào)，說明IR組也出現(xiàn)了一定程度的適應(yīng)性反應(yīng)，但可能其產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)不足以抵消缺血再灌注引起的損傷效應(yīng)，最終導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能的破壞。

總之，晚期缺血預(yù)適應(yīng)對腎臟有明確的保護(hù)作用，能顯著減輕IR引起的腎臟功能和病理性損傷，提高小鼠存活率。其保護(hù)作用可能與促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子和包括VEGF和Glut-1在內(nèi)的靶基因表達(dá)有關(guān)，在此基礎(chǔ)上尋找模擬缺血預(yù)處理的藥物用于臨床治療將具有更重要的意義。

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Protectiveeffectofdelayedischemicpreconditioningonrenalischemia/reperfusioninjuryviainductionofhypoxiainduciblefactor

XU Xia-lian, JIANG Su-hua, XU Xun-hui, LIU Hong, DING Xiao-qiang

(DepartmentofNephrology,ZhongshanHospitalofFudanUniversity,Shanghai200032,China.E-mail:dxq93216@medmail.com.cn)

AIM: To investigate the effects of delayed ischemic preconditioning on renal ischemia-reperfusion injury in mice and to study the role of hypoxia inducible factor 1α(HIF-1α).METHODSMale C57/BL6N mice were randomly divided into 3 groups: sham operation group(sham), ischemia/reperfusion group(IR) and ischemic preconditioning group(IPC). Thirty-minute ischemia was induced by clamping renal bilateral pedicles followed by reperfusion in IR group. Fifteen-minute pre-ischemia was performed 4 days before IR in IPC group. Serum creatinine(Scr), blood urea nitrogen(BUN), kidney morphology and apoptosis were observed at different time points following reperfusion. The expression of HIF-1α in the renal tissues was evaluated by the methods of immunohistochemistry and Western blotting analysis. The mRNA expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and glucose transporter-1(Glut -1) was detected by real-time quantitative RT-PCR.RESULTSCompared with IR group at 24 h following reperfusion, acute tubulointerstitial injury was significantly relieved in IPC group. The levels of Scr and BUN, and apoptosis of tubular epithelial cells were also decreased in IPC group. Nuclear expression of HIF-1α was higher in IPC group than that in IR group. The mRNA expression of VEGF and Glut-1, the target genes of HIF-1, was also increased significantly in IPC group.CONCLUSIONDelayed ischemic preconditioning attenuates both morphologic and functional injuries induced by renal ischemia/reperfusion. This protective effect may be related to the increased expression of hypoxia inducible factor.

Kidney; Ischemic preconditioning; Ischemia-reperfusion; Hypoxia-inducible factor

R692.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-021

1000-4718(2011)02-0320-06

2010-08-30

2010-11-08

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30871176; No.30971374)

△通訊作者 Tel：021-64041990-2138; E-mail: dxq93216@medmail.com.cn

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