Wnt在胰島素抵抗大鼠海馬Aβ沉積中的作用及羅格列酮治療前后Aβ的變化

楊思思, 張曉潔， 張木勛

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院內分泌科， 湖北 武漢 430030)

Wnt在胰島素抵抗大鼠海馬Aβ沉積中的作用及羅格列酮治療前后Aβ的變化

楊思思, 張曉潔， 張木勛△

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院內分泌科， 湖北 武漢 430030)

目的探討經典Wnt通路中的配體Wnt3a及下游胞內的β-catenin與胰島素抵抗(IR)大鼠模型海馬中β淀粉樣肽(Aβ)沉積的關系；觀察IR模型大鼠經羅格列酮治療后，上述各指標的改變及與過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)的相關性。方法高糖、高脂、高蛋白飲食3個月造IR大鼠模型(IR)，給予羅格列酮灌胃4周為治療組(TZD)；葡萄糖氧化酶法檢測大鼠血糖水平，放免法檢測血漿胰島素水平，HOMA-IR評估胰島素抵抗水平，蛋白印跡技術檢測大鼠海馬內Aβ、Wnt3a、β-catenin及PPARγ的水平。結果IR組血漿胰島素水平及胰島素抵抗程度顯著高于對照組。免疫印跡結果顯示，IR組大鼠海馬中Aβ及β-catenin表達增加，Wnt3a及PPARγ表達明顯減少；經TZD干預后，大鼠海馬中Aβ表達減少，Wnt3a、β-catenin及PPARγ表達增加。結論胰島素抵抗大鼠海馬內Wnt信號通路水平下降可能是導致Aβ沉積的原因。羅格列酮作為PPARγ激動劑，可通過上調Wnt通路活性從而減少IR大鼠海馬內Aβ的沉積。

胰島素抵抗； 淀粉樣β肽； Wnt信號通路； 羅格列酮；過氧化物酶體增殖物激活受體γ

胰島素抵抗(insulin resistance,IR)及高胰島素血癥在肥胖人群中常見，流行病學研究顯示IR是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)強烈的預測因子之一[1]。AD是一種與年齡相關的嚴重中樞神經系統退行性疾病，嚴重損害患者的認知功能，造成患者自理能力障礙及精神行為的異常。AD患者最典型的病理改變是：腦細胞外β淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ)沉積導致的老年斑及腦神經細胞軸突內tau蛋白過度磷酸化所導致的神經纖維纏結[2]，并且認為Aβ沉積是AD的始發病理生理學改變[3]。研究證實，腦內胰島素信號受損可促使Aβ沉積[4]，并且IR及Aβ沉積均可導致Wnt信號通路(the wingless pathway in Drosophila)下調[5，6]。

Wnt信號通路是Wnt配體介導的經典信號通路，Wnt配體(如Wnt3a，是一類分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌發揮作用)與其膜受體Frizzled結合介導了跨膜信號轉導，激活胞質內的蓬亂蛋白(dishevelled protein，Dsh)，使得糖原合成激酶-3β( glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)結合到由軸蛋白(Axin)、大腸腺瘤性息肉蛋白(APC)及β-catenin組成的復合體上從而失去其活性，最后導致細胞內β-catenin的水平增加，其進入細胞核內與轉錄因子TCF/LEF結合最終使得Wnt目的基因表達增加。

噻唑烷二酮類藥物(TZD)是迄今為止被認為是最強的過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)激動劑，而PPARγ不僅是Wnt/β-catenin的目的基因之一，并且PPARγ與激動劑結合后還能上調β-catenin基因轉錄。因此本研究首先觀察IR大鼠Aβ水平及通過檢測β-catenin和Wnt3a水平來評估Wnt途徑活性的改變，然后給予TZD干預改善IR后，通過檢測兩者的變化，探討羅格列酮是否通過Wnt途徑改善Aβ沉積，從而降低AD在IR中發病風險。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實驗對象 雄性SD大鼠( 華中科技大學同濟醫學院動物中心提供)，體重180-220 g ，10-12周齡．隨機將大鼠分為3組：對照組予正常飲食飼養；肥胖胰島素抵抗模型組(IR) 予高脂高糖高蛋白飲食飼養；羅格列酮治療組(TZD)予高糖高脂高蛋白飼養3月，以羅格列酮片3.0 mg·kg-1·d-1灌胃4周(羅格列酮片由格蘭素史克公司提供)，對照組IR組均以等劑量生理鹽水灌胃。灌胃4周后斷頸處死所有大鼠，取海馬。

1.2主要試劑 見表1。

2觀察指標及方法

2.1血糖測定(plasma glucose) 處死前由大鼠尾靜脈采血，用血糖儀(強生穩豪)檢測血糖水平。

2.2血漿胰島素測定(plasma insulin) 于大鼠被處死前心臟取血1 mL，離心后取血漿，-20 ℃保存，放免法檢測。藥盒購自北京原子能研究所, 測定值批內CV<2.5%，批間CV<3.5%。

2.3胰島素抵抗指標 以穩態模型的胰島素抵抗指數HOMA -IR =空腹胰島素(U/L)×空腹葡萄糖(mmol/L)÷22.5表示。

2.4免疫印跡技術檢測大鼠海馬中Aβ、Wnt3a、β-catenin及PPAR-γ水平 斷頸處死動物取海馬放入勻漿器內，加入蛋白質提取液，冰上勻漿(總蛋白質提取液購自武漢凌飛科技公司)。于4 ℃ 12 000×g離心10 min ，取上清即為蛋白質。取10 μL用Bradford法檢測蛋白質濃度，余儲存于-80 ℃備用。用前加 2×樣本緩沖液并混勻，于100 ℃變性5 min。在具10道雙垂直電泳槽孔內加入約 12 μg蛋白質,10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，結束后全濕轉至NC膜。搖床上5%BSA封閉2 h，雜交I抗( 所有抗體如表 2所示) 4 ℃過夜，PBST洗膜3次，每次10 min，雜交Ⅱ抗(辣根酶標記的羊抗兔、羊抗鼠及兔抗羊IgG購自Santa Cruz)，室溫搖床上1 h，PBST洗膜3次，每次10 min。ECL試劑盒顯色(ECL試劑盒購于武漢凌飛科技公司)。運用BandScan 5.0軟件對免疫反應條帶進行定量分析。

3統計學處理

表1 實驗所用抗體

結 果

1血漿胰島素及胰島素抵抗程度比較

IR組大鼠胰島素水平顯著高于對照組，根據HOMA公式計算出的胰島素抵抗指數顯示IR組HOMA-IR顯著高于對照組，說明造模成功，見表2。

表2 動物分組及一般資料

2免疫印跡技術檢測大鼠海馬內Aβ、Wnt3a、β-catenin及PPARγ的表達

免疫印跡結果顯示，與對照組大鼠相比IR組大鼠海馬中Aβ及β-catenin表達增加，Wnt3a及PPARγ表達明顯減少；與IR組大鼠相比，TZD組大鼠海馬中Aβ表達減少，Wnt3a、β-catenin及PPARγ表達增加,見圖1。

Figure 1. Western blotting analysis of Wnt3a,β-catenin and PPAR-γ in rat hippocampi. A: Crude hippocampal extracts(7-13 μg/lane) were analyzed by Western blotting developed with antibodies to Wnt3a, β-catenin and PPARγ. β-actin served as a loading control. Each lane was from an individual rat. B: the blots as shown in panel A were quantitated densitometrically. ±s. n=5. *P<0.05,**P<0.01 vs control group; #P<0.05，##P<0.01 vs IR group.

討 論

IR程度是AD發病的強烈預測因子之一，腦內胰島素信號受損可促使Aβ沉積[4]，并且胰島素抵抗程度及Aβ沉積的增加均可導致Wnt信號通路下調[5，6]。TZD藥物是迄今為止被認為最強的PPARγ受體激動劑，臨床上多用于減輕IR。研究證實，PPARγ不僅是Wnt/β-catenin的目的基因之一，與激動劑結合后還能上調其下游β-catenin的基因轉錄，本研究運用TZD類藥物羅格列酮改善胰島素抵抗狀態，通過檢測Wnt信號途徑中β-catenin及Wnt3a水平觀察Wnt途徑活性改變，然后檢測大鼠大腦Aβ沉積狀態，探討TZD通過Wnt途徑改善胰島素抵抗大鼠大腦Aβ沉積狀態的可能機制。

本研究中，我們首先檢測具有胰島素抵抗特征的大鼠大腦Aβ沉積狀態，結果顯示，IR組大鼠比對照組大鼠大腦內Aβ表達增多。檢測Wnt通路中重要組成成分，結果顯示，與對照組比較，IR組β-catenin水平增高，Wnt3a表達減少。在胰島素抵抗時Wnt/β-catenin信號通路應該是被抑制，因此理論上β-catenin應該是表達減少的。分析在本實驗中其β-catenin表達增多是因為在OB組中，IR導致Aβ增多，而Aβ增多可反饋性地增加β-catenin表達。這又是因為增加的β-catenin可直接減少Aβ的生成[7]。另外，β-catenin表達增加的同時Wnt3a表達反而是下降的，這說明此時β-catenin表達增加，可能并不是通過Wnt3a配體激活Wnt/β-catenin經典通路來實現的。因為Wnt經典通路中Wnt3a及β-catenin的變化應該是一致的：Wnt3a為Wnt經典通路中的配體而β-catenin為配體下游的蛋白。然而，β-catenin的表達還受許多其它因素的影響，如非經典Wnt通路及與GSK-3β有關的信號通路影響。另一研究也支持此推論：當Aβ表達增多時它可與Wnt膜受體Frizzled的半胱氨酸域結合從而抑制Wnt/β-catenin經典作用通路[8]。IR導致Aβ沉積的機制主要有2種學說。(1)受損的胰島素信號通路對胰島素信號轉導系統中的關鍵酶GSK-3β及GSK-3α的抑制作用減弱[9]。激活的GSK-3α可以激活APPγ分泌酶從而增加Aβ的產生;而激活的GSK-3β可使得tau過度磷酸化從而導致神經纖維纏結[10]，兩者都可加快疾病的進程。(2)胰島素抵抗導致Aβ沉積是通過影響其清除及生成過程實現的。Aβ被認為主要是通過血腦屏障或是小膠質細胞清除的，這個過程依賴低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)及其配體ApoE和α2巨球蛋白[11]。而本次實驗結果顯示OB組比對照組海馬中Wnt3a明顯下降而Aβ沉積增加，因此我們推測IR導致Aβ沉積另一可能的機制是：IR時Wnt/β-catenin信號通路被抑制從而導致Aβ沉積。TZD治療組大鼠較OB組Aβ表達減少、Wnt3a及β-catenin表達增多、 PPARγ表達增多。依此推測羅格列酮可改善IR并且上調Wnt，經典Wnt通路上調可使Aβ沉積減輕，同時羅格列酮的核受體PPARγ不僅是Wnt通路的目的基因之一[12]，并且當羅格列酮作用與PPARγ結合后又可上調β-catenin基因的轉錄。PPARγ表達增多可增強羅格列酮的作用，并且上調β-catenin表達。

總之，AD作為IR患者的重要并發癥之一越來越受到人們重視，找出兩者間發病的關鍵及相關因素有望干預病情發展。Wnt/β-catenin通路在IR及AD發病中均起到重要作用，其可能為 IR患者患AD的病理生理學基礎之一。

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RoleofWntpathwayinAβdepositioninhippocampusofinsulinresistantratsbeforeandaftertreatedwithrosiglitazone

YANG Si-si, ZHANG Xiao-jie, ZHANG Mu-xun

(DepartmentofEndocrinology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:zmx1220@sina.com)

AIM: To investigate the relationship between classical Wnt pathway with β-amyloid peptide(Aβ) deposition in hippocampus of insulin resistance(IR) rat model and to observe the above-mentioned proteins and the correlation with peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ) by treating the IR rats with rosiglitazone.METHODSThe rat models of IR and TZD were made. The plasma insulin and the plasma glucose levels were tested by RIA and glucose-oxidase methods, respectively. The indexes of insulin resistance were calculated by HOMA-IR. The proteins of Aβ, Wnt3a, β-catenin and PPARγ were analyzed by Western blotting.RESULTSThe plasma insulin in IR group was significantly higher than that in control group. Insulin resistance, which was calculated by HOMA-IR, was significantly higher in IR group than that in control group. The levels of Aβ and β-catenin in IR group were higher than those in control group, while the levels of Wnt3a and PPARγ were decreased. After treatment with rosiglitazone, Aβ was reduced but Wnt3a, β-catenin and PPARγ were increased.CONCLUSIONIn hippocampus of IR rats, Aβ is deposited and the levels of Wnt3a and Wnt are reduced. Rosiglitazone, as a PPARγ agonist, can upregulate the activity of Wnt pathway and reduce Aβ deposition in rat hippocampus.

Insulin resistance; β-amyloid; Wnt signaling pathway; Rosiglitazone; Peroxisomal proliferator-activated receptor γ

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-031

1000-4718(2011)02-0375-04

2010-06-28

2010-10-12

△通訊作者 Tel:027-83663615； E-mail: zmx1220@sina.com