細胞周期素D1、視網膜母細胞瘤樣蛋白2及微小染色體維持蛋白7在肝細胞癌中的表達及對預后的意義

劉 娟, 殷 飛, 姚樹坤

(1東南大學附屬中大醫院消化內科, 江蘇 南京 210009; 2河北醫科大學第四醫院消化內科, 河北 石家莊 050011； 3衛生部中日友好醫院消化內科, 北京 100029)

細胞周期素D1、視網膜母細胞瘤樣蛋白2及微小染色體維持蛋白7在肝細胞癌中的表達及對預后的意義

劉 娟1△, 殷 飛2, 姚樹坤3

(1東南大學附屬中大醫院消化內科, 江蘇 南京 210009;2河北醫科大學第四醫院消化內科, 河北 石家莊 050011；3衛生部中日友好醫院消化內科, 北京 100029)

目的研究細胞周期素D1(cyclin D1)、視網膜母細胞瘤樣蛋白2(RBL2/p130)及微小染色體維持蛋白7(MCM7)在肝細胞癌(以下簡稱肝癌)中的表達及對預后診斷的意義。方法用免疫組織化學法檢測44例肝癌組織、26例癌旁硬化肝組織及18例正常肝組織中cyclin D1、RBL2/p130及MCM7的表達情況，并分析其與肝癌患者臨床參數間的關系。結果肝癌組織中cyclin D1和MCM7的陽性表達率分別是68.2%和72.7%，顯著高于正常肝組織及癌旁硬化肝組織(P<0.01)；RBL2/p130的陽性表達率為34.1%，顯著低于正常肝組織及癌旁硬化肝組織(P<0.01)，MCM7與cyclin D1的表達呈正相關(r=0.349,P<0.05)，與RBL2/p130的表達呈負相關(r=-0.421,P<0.01)；cyclin D1與RBL2/p130的表達呈負相關(r=-0.435,P<0.01)。Cyclin D1及MCM7的表達與腫瘤包膜的完整性、腫瘤分化程度及肝癌臨床分期有關，RBL2/p130的表達與有無門脈癌栓、腫瘤分化程度及肝癌臨床分期有關(P<0.05)。MCM7還與腫瘤大小及甲胎蛋白(AFP)值的大小有關。多因素分析顯示腫瘤大小、MCM7及cyclin D1與肝癌預后相關(P<0.05)。MCM7及cyclin D1陽性表達的患者、RBL2/p130陰性表達的患者預后差(P<0.05)。結論Cyclin D1、RBL2/p130和MCM7的異常表達在肝癌形成過程中發揮了重要作用。監測其在肝癌中的表達情況將有助于判斷肝癌患者的預后。

細胞周期蛋白D1； 視網膜母細胞瘤樣蛋白質； 微小染色體維持蛋白質； 肝腫瘤

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，大多數患者就診時已屬晚期，及早對其進行有效干預是改善其療效的關鍵。到目前為止，肝癌的發病機制仍不十分明了。近年來對細胞生長調控機制的研究中，DNA復制起始調控在其中的核心作用已被提出。微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance protein，MCM)是真核細胞DNA復制前復合體的重要組成部分，為所有真核細胞DNA復制啟動所必需[1]。視網膜母細胞瘤樣蛋白2(retinoblastoma-like protein 2，RBL2/p130)是近年來發現的Rb基因家族新成員的表達產物，在細胞周期不同階段發揮負調控功能，它們的異常表達均會引起細胞周期調控失常從而導致細胞癌變的發生。我們先前的基因芯片研究首次發現MCM7 mRNA及RBL2/p130 mRNA在肝癌組織中差異表達[2],提示復制起始及轉錄調控異常在肝癌的發生中可能發揮了重要作用，本次研究中，我們利用免疫組化技術在蛋白水平上進一步研究它們在肝癌中的表達狀況，進而探討其臨床意義。

材 料 和 方 法

1標本來源及處理

44例原發性肝細胞癌組織、26例癌旁硬化肝組織(腫瘤周邊2 cm以外的無癌硬化肝組織)及18例肝血管瘤周邊正常肝組織為2005年7月至2008年3月手術切除后經10%中性甲醛固定后石蠟包埋標本。所有肝癌患者(無其它肝病)術前均未進行任何形式的治療，其中男性37例，女性7例，年齡33-71歲，平均52歲。臨床分期按2001年9月中國抗癌協會肝癌專業委員會制定標準對患者進行分期[3]，I期11例，Ⅱ期16例，Ⅲ期17例。所有組織類型均經病理科確診，并按Edmondson-Steiner分級,其中I-Ⅱ級24例,Ⅲ-IV級20例。所有患者均術后隨訪至2009年6月。

2免疫組織化學染色石蠟包埋組織切片4 μm厚，常規脫蠟至水，0.3%H2O2室溫下15-20 min，以阻斷內源性過氧化物酶，充分水洗，在pH 9.0的Tris/EDTA液中高壓3 min(MCM7)或在pH 6.5的檸檬酸緩沖液中高壓20 min(RBL2/p130及cyclin D1)，進行抗原修復，室溫冷卻，分別加入按1∶100稀釋的濃縮型鼠抗人單克隆抗體MCM7、RBL2/p130或兔抗人多克隆抗體cyclin D1，4 ℃冰箱過夜，此后步驟及顯色按二步法試劑盒說明進行，蘇木素復染，常規脫水，透明，封片。二步法免疫組化檢測試劑盒購自上海基因公司，濃縮型鼠抗人單克隆抗體MCM7、RBL2/p130及濃縮型兔抗人多克隆抗體cyclin D1均購自Neomarker。以不加Ⅰ抗作為陰性對照，以PBS代替Ⅰ抗作為空白對照，用已知陽性片作為陽性對照。

3結果判定

采用雙盲法，由2位病理醫師獨立觀察每張切片5個具有代表性的高倍視野，組織切片中胞質或細胞核中出現棕黃色顆粒為陽性細胞標志。根據細胞質或核的染色程度及染色細胞百分率進行分析評分：不著色為0分，著色淡為1分，深者3分。著色細胞占計數細胞百分率<10%為0分，>10%者為陽性表達，10%-30%為1分，31%-60%為2分，>61%為3分。將每張切片著色程度得分與著色細胞百分率得分相乘為其最后得分。

4統計學處理

用SPSS 11.5軟件進行統計分析，各項指標與臨床參數的關系應用2檢驗，檢測指標間的關聯分析采用Spearman相關分析，預后單因素分析采用Kapplan-Meier曲線及log-rank檢驗，多因素分析采用Cox比例風險模型。

結 果

1CyclinD1、RBL2/p130及MCM7在不同肝組織中的表達

Cyclin D1及RBL2/p130在各組肝組織中均有表達，主要表現為胞核著色。MCM7在癌旁硬化肝組織及正常肝組織中均不表達，在肝癌組織中表現為核著色。

2CyclinD1在肝癌組織中的表達情況與臨床參數間的關系

Cyclin D1在肝癌中的陽性表達率為68.2%，顯著高于癌旁硬化肝組織及正常肝組織(P<0.01)。其表達水平與患者年齡、性別、有無門脈癌栓、癌灶個數、腫瘤直徑、甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)值及乙肝表面抗原陽性與否無關；cyclin D1蛋白在無包膜及包膜不完整的癌組織中的陽性率分別為83.3%、88.2%，均顯著高于在包膜完整的癌組織中的陽性率47.6%(P<0.05)；肝癌分期越晚，cyclin D1蛋白的陽性率越高。Ⅲ期癌組織中的陽性率94.1%顯著高于I期的45.4%(2=6.21，P<0.05)和Ⅱ期的56.3%(P<0.05)；肝癌的病理分級越高，癌組織中cyclin D1蛋白的陽性表達率越高，Ⅲ級及IV級癌組織中的陽性率為85.0%，顯著高于其在I級及Ⅱ級癌組織中的陽性率54.2%(P<0.05),見表1、2、圖1。

表1 Cyclin D1、RBL2/p130和MCM7在不同肝組織中的表達

表2 Cyclin D1、RBL2/p130和MCM7的表達與肝癌患者臨床參數間的關系

Figure 1. The expression of MCM7, RBL2/p130 and cyclin D1 in different groups.A:the expression of MCM7 in HCC(SP,×400)；B：the expression of MCM7 in normal liver(SP,×200)；C：the expression of RBL2/p130 in HCC(SP,×400)；D：the expression of RBL2/p130 in normal liver(SP,×400)；E：the expression of cyclin D1 in HCC(SP,×400)；F：the expression of cyclin D1 in normal liver(SP,×400).

3RBL2/p130在肝癌中的表達情況及與臨床參數間的關系

RBL2/p130在肝癌中的陽性表達率為34.1%，顯著低于癌旁硬化肝組織及正常肝組織(P<0.01)。其表達率與有無門脈癌栓、腫瘤分化程度及肝癌臨床分期有關，與患者年齡、性別、癌灶個數、腫瘤大小、腫瘤包膜完整與否、AFP值的大小及乙肝表面抗原陽性與否無關,見表1、2、圖1。

4MCM7在肝癌組織中的表達情況及與臨床參數間的關系

MCM7在肝癌組織中的陽性表達率是72.7%，其表達水平與患者年齡、性別、有無門脈癌栓、癌灶個數及乙肝表面抗原陽性與否無關；與AFP值、腫瘤直徑、腫瘤包膜完整性、臨床分期及病理分級有關,見表2、圖1。

5單因素預后分析結果

應用Kaplan-Meier法對HCC患者累積生存曲線進行log-rank檢驗，結果顯示cyclin D1表達陽性的患者累計生存率顯著低于陰性患者(P<0.01)。MCM7表達陽性患者累計生存率顯著低于陰性患者(P<0.01)，RBL2/p130陽性患者累計生存率顯著高于陰性患者(P<0.05)，見圖2-4。

6CyclinD1、RBL2/p130及MCM7間的相關性及多因素分析結果

Cyclin D1與MCM7在肝癌中的表達呈正相關(r=0.349,P<0.05)，二者與RBL2/p130的表達呈負相關(分別為r=-0.435、r=-0.421,P<0.01)。多因素分析顯示：腫瘤直徑(P<0.05)、MCM7(P<0.05)及cyclin D1(P<0.05)是影響肝癌預后的獨立因素,見表3、4。

Figure 2. The relationship between MCM7 expression and HCC prognosis.

Figure 3. The relationship between RBL2/p130 expression and HCC prognosis.

Figure 4. The relationship between cyclin D1 expression and HCC prognosis

表3 MCM7的表達與RBL2/p130、cyclin D1間的關系

表4 影響肝癌預后的多因素分析

討 論

Cyclin D1是一種反應細胞周期變化的蛋白，在正常細胞周期中，cyclin D1與CDK4形成復合物cyclin D1-CDK4，使Rb蛋白磷酸化，從而失去抑制轉錄因子E2F的活性，解除Rb調控G1期停滯作用，啟動DNA合成，使細胞周期從G1期進入S期，促進細胞增殖。cyclin D1過度表達可縮短細胞周期G1/S期轉換時間,增加細胞周期轉換速度,導致細胞增殖失控而癌變[4]。研究表明cyclin D1在多種腫瘤中過度表達，并與腫瘤的發生發展關系密切[5]。Patil等[6]研究認為cyclin D1的高表達在c-Met和β-catenin誘發的肝癌產生中發揮了促進作用。本次研究證實，肝癌組織中cyclin D1陽性表達率顯著高于癌旁硬化肝組織及正常肝組織，并且其表達水平在腫瘤分化程度越低，臨床分期越晚的患者中越高，并且，cyclin D1陽性表達的肝癌患者預后差。這些均提示cyyclin D1的過度表達在HCC的發生、發展中發揮著重要的作用。

RBL2/p130，是視網膜母細胞瘤易感基因家族的3個產物之一， RBL2/p130是一個典型的抑癌基因，通過阻斷E2F轉錄調節因子家族的活性，使許多參與細胞周期的基因在G0期處于轉錄靜止狀態，在細胞周期中發揮著負性調控的作用。目前，有關p130在肝癌中的表達情況的研究結果并不一致。Huynh[7]研究發現肝癌組織中p130蛋白表達較正常組織升高，認為是機體對腫瘤難以控制的增殖的一種保護性反應；而Claudio等[8]研究認為p130在肝癌組織中表達下調，并且其表達水平與腫瘤的惡性程度呈負相關。本研究結果顯示，p130在肝癌中的表達水平明顯低于癌旁硬化肝組織及正常肝組織，有門脈癌栓者、肝癌組織分化程度越差、肝癌患者臨床分期越晚，其表達水平越低。并且，RBL2/p130陰性表達的肝癌患者預后差。這些結果均提示，RBL2/p130的失活促進了肝細胞的惡性增殖及轉移。

MCM是一個保守的蛋白家族，MCM2-7復合物在真核細胞的復制起始和延伸中發揮著重要的作用。MCM2-7與DNA復制起始點結合，與其后幾種被募集的起始因子共同組裝成復制前起始復合物，這一復合物“準許”染色質開始復制。并且，MCM4/6/7二聚體復合體有解螺旋酶活性和ATP水解活性，能夠使雙鏈DNA解鏈，使復制得以延伸。在復制起始后，MCM2-7則從染色質中解離，在復制期間不再裝配前復制復合物以確保每個細胞周期DNA復制的起始和延伸只發生1次。正常細胞中MCM蛋白的mRNA水平隨著細胞周期的變化而改變，MCM蛋白的表達在G1/S轉換達峰值，當細胞進入G0期和分化、衰老時，MCM表達的水平下降甚至不能檢測出[9]。近年來研究發現，MCM蛋白在多種腫瘤組織中表達上調，并與腫瘤細胞的增殖狀態、預后有關[10]。Iizuka等[11]研究認為MCM7等受c-myc調節的基因在C基因型乙型病毒性肝炎所致肝癌中高水平表達，并且與肝癌的發生有關。我們前期研究發現MCM家族中MCM7在肝癌組織中高表達[2]，此次進一步研究發現MCM7蛋白僅在肝癌組織中表達，在正常肝組織及癌旁硬化肝組織中均不表達。隨著臨床分期的增加、組織分化程度的降低、瘤組織包膜的不完整性及腫瘤直徑的增加，MCM7的表達水平也更高。而且，在AFP<400 μg/L的肝癌患者中MCM7的陽性率仍可達到56.5%，顯示出MCM7具有較AFP更高的肝癌特異性。并且，MCM7陽性表達的肝癌患者預后差。這些均提示MCM7 與肝癌的增殖狀態和預后密切相關。

從以上情況可以看出，cyclin D1、RBL2/p130和MCM7在肝癌組織中均異常表達，它們的活化或失活在細胞周期復制起始階段促進了肝細胞的惡性增殖。它們之間是否存在內在聯系？相關分析發現，肝癌組織中cyclin D1與MCM7的表達情況之間存在著正相關關系，二者的表達水平與RBL2/p130蛋白的表達水平呈負相關。前面提到，RBL2/p130能夠調節E2F轉錄調節因子家族的活性，而E2F是許多與G1/S過渡有關的基因表達所需要的，這些基因之中就包括MCM。研究表明，MCM7與RBL2/p130之間存在相互作用[12]，而具有催化活性的cyclin D1/CDK4能與復制前復合物中的MCM7特異性的結合，通過磷酸化Rb來促使其與MCM7的分離，使復制起始點的裝配得以完成，細胞進入細胞周期，DNA開始復制[13]。然而，在腫瘤中大多數細胞處于細胞周期中，cyclin D1及MCM7的高表達也許僅僅反映了這些細胞正處于G1期，同樣，在G0期高表達的RBL2/p130也可以由細胞所處周期解釋為什么它在HCC中較低陽性表達率，下一步我們將用Ki67的染色來幫助判斷這些細胞是否在細胞周期中。另外，RBL2/p130的基因位點位于16 q，在肝癌中經常缺失，是否突變導致了這3個基因的異常表達仍有待于進一步研究。

綜合以上情況，我們認為cyclin D1，RBL2/p130和MCM7的異常表達在肝癌的形成過程中發揮了重要的作用。Cyclin D1、RBL2/p130及MCM7可以作為判斷肝癌生物學行為和預后的重要指標。

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ExpressionandprognosticsignificanceofcyclinD1,RBL2/p130andMCM7inhepatocellularcarcinoma

LIU Juan1, YIN Fei2, YAO Shu-kun3

(1DepartmentofGastroenterology,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China;2DepartmentofGastroenterology,TheFourthHospital,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China;3DepartmentofGastroenterology,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029,China.E-mail:hepatology-2003@163.com)

AIM: To investigate the expression and prognostic significance of cyclin D1, retinoblastoma-like protein 2(RBL2/p130) and minichromosome maintenance protein 7(MCM7) in hepatocellular carcinoma(HCC).METHODSThe expression of cyclin D1, RBL2/p130 and MCM7 in 44 HCC specimens, 26 adjacent noncancerous cirrhotic liver specimens and 18 normal liver specimens were detected by the method of immunohistochemistry. The correlations of cyclin D1, RBL2/p130 and MCM7 with the clinical parameters of HCC patients were analyzed.RESULTSThe positive expression rates of cyclin D1 and MCM7 in HCC were 68.2% and 72.7%, higher than those in normal livers and adjacent noncancerous cirrhotic livers(P<0.01). The positive expression rate of RBL2/p130 in HCC was 34.1%, lower than that in normal livers and adjacent noncancerous cirrhotic livers(P<0.01). The expression of MCM7 in HCC was positively correlated with the expression of cyclin D1(r=0.349,P<0.05), and negatively correlated with the expression of RBL2/p130(r=-0.421,P<0.01). The expression of cyclin D1 in HCC was negatively correlated with the expression of RBL2/p130(r=-0.435,P<0.01). The expression of MCM7 and cyclin D1 was associated with the integrity of tumor capsule, differentiation degree and TNM stage(P<0.05). The expression of MCM7 was also associated with tumor size and the value of alpha fetoprotein(AFP). The tumor size, the expression levels of MCM7 and cyclin D1 were correlated with the prognosis determined by multivariable analysis. The patients with positive expression of MCM7 and cyclin D1 had lower survival rate than those with negative expression(P<0.05). The patients with positive expression of RBL2/p130 had higher survival rate than those with negative expression(P<0.05).CONCLUSIONThe abnormal expression of cyclin D1, RBL2/ p130 and MCM7 plays an important role in the development of HCC, indicating that monitoring their expression in HCC patients may be helpful to the judgment of prognosis.

Cyclin D1; Retinoblastoma-like protein; Minichromosome maintenance protein; Liver neoplasms

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-018

1000-4718(2011)02-0304-06

2010-06-11

2010-12-17

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Tel：025-83272034; E-mail：hepatology-2003@163.com