不同濃度葡萄糖、胰島素對新生大鼠心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的影響

王 梅， 楊 蓉， 王亞玲， 劉金明， 李擁軍， 張 輝， 奇 釗

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科， 河北 石家莊 050000)

不同濃度葡萄糖、胰島素對新生大鼠心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的影響

王 梅， 楊 蓉， 王亞玲， 劉金明， 李擁軍△， 張 輝， 奇 釗

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科， 河北 石家莊 050000)

目的觀察心肌細(xì)胞能否表達(dá)脂聯(lián)素(APN)，并探討高糖、高胰島素狀態(tài)下心肌細(xì)胞APN表達(dá)的變化。方法Sprague-Dawley(SD)大鼠的乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，分為葡萄糖6組：高滲對照組、5.5 mmol/L組、20 mmol/L組、25 mmol/L組、30 mmol/L組和50 mmol/L組。胰島素6組：0 mol/L組、10-10mol/L組、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組和10-6mol/L組。干預(yù)48 h,用RT-PCR法測定心肌細(xì)胞APNmRNA表達(dá)的差異，并檢測心肌細(xì)胞APN蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果在葡萄糖濃度小于30 mmol/L組中，心肌細(xì)胞APN表達(dá)隨葡萄糖濃度的增加而減低(P<0.05)，30 mmol/L和50 mmol/L組APN表達(dá)顯著差異；滲透壓對于心肌細(xì)胞APN表達(dá)無影響；在胰島素濃度低于10-7mol/L組中，心肌細(xì)胞APN表達(dá)隨胰島素濃度的增加而減低(P<0.05)，在高于10-7mol/L組中，心肌APN表達(dá)無顯著差異。結(jié)論心肌細(xì)胞能夠表達(dá)脂聯(lián)素。在一定范圍內(nèi)，隨葡萄糖、胰島素濃度增加，心肌細(xì)胞APN的表達(dá)水平下降。

心肌細(xì)胞； 脂聯(lián)素； 葡萄糖； 胰島素； 大鼠

胰島素抵抗(insulin resistance, IR)作為2型糖尿病的主要病理生理基礎(chǔ)，在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，是糖尿病發(fā)生心血管并發(fā)癥的重要危險(xiǎn)因子[1]。脂聯(lián)素(adiponectin, APN) 是近年來發(fā)現(xiàn)的由脂肪細(xì)胞分泌與胰島素抵抗關(guān)系最密切的特異性細(xì)胞因子，被認(rèn)為是胰島素抵抗的標(biāo)記物[2]。脂聯(lián)素的表達(dá)受一系列激素和環(huán)境因素影響。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肌肉組織、肝臟亦能表達(dá)脂聯(lián)素。目前，僅有少數(shù)國外文獻(xiàn)表明心肌細(xì)胞可以表達(dá)脂聯(lián)素，但高血糖和高胰島素對心肌細(xì)胞APN表達(dá)有何影響，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用不同濃度葡萄糖、胰島素對體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察其對心肌細(xì)胞APN表達(dá)的影響。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

2-3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2藥品與試劑

DMEM低糖培養(yǎng)液、D-Hanks、Ⅱ型膠原酶干粉、Trizol均為Gibco產(chǎn)品；胰蛋白酶干粉為Hyclone產(chǎn)品；新生牛血清、D-甘露醇、牛胰島素、多聚甲醛為Sigma產(chǎn)品；雙抗為Invitrogen產(chǎn)品；BrdU為Boster產(chǎn)品；多聚賴氨酸為Amresco產(chǎn)品；APN抗體為Abcam產(chǎn)品； PCR擴(kuò)增試劑為Promega產(chǎn)品；RT-PCR檢測試劑盒為大連寶生工程有限公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程有限公司合成；瓊脂糖為北方同正產(chǎn)品；其它試劑均為分析純。混合酶消化液配置方法：胰蛋白酶干粉0.08 g, Ⅱ型膠原酶干粉0.032 g，加入37 ℃預(yù)熱的D-Hanks液至80 mL，搖勻，過濾除菌，即用即配。

3心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法

取新生2-3 d的SD大鼠，在無菌的條件下，開胸取出心臟，用D-Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，加入混合酶消化液，取消化完畢后的上清液，200目細(xì)胞網(wǎng)篩過濾，所得細(xì)胞懸液差速貼壁后以1×109cells/L接種于6孔板，加入5-溴脫尿苷(BrdU，0.1 mmol/L)，在二氧化碳孵育箱內(nèi)以含10%血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

4實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法

常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞48 h后，換液為無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。之后將6孔板上的細(xì)胞每3孔分為1組，共分12組，換培養(yǎng)基的同時(shí)進(jìn)行分組干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。分組如下：(1)葡萄糖干預(yù)，高滲組(含有5.5 mmol/L葡萄糖和45 mmol/L甘露醇，其滲透壓與50 mmol/L高糖組相當(dāng)，所含糖濃度與5.5 mmol/L組相當(dāng)，用以排除滲透壓變化對于心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的影響)、5.5 mmol/L組、20 mmol/L組、25 mmol/L組、30 mmol/L組、50 mmol/L組；(2)胰島素干預(yù),0 mol/L組、10-10mol/L組、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組、10-6mol/L組。

5RT-PCR檢測APNmRNA的表達(dá)

引物序列如下:ANP正義鏈 5’-CAGGAGATGCTGGAATGA-3’，反義鏈 5’-GATACTGGTCGTAGGTGAAG-3’；β-actin正義鏈 5’-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，反義鏈 5’-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3’。按照Trizol試劑說明書提取心肌細(xì)胞總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng), 共35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物10 μL經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶 染色、照相并經(jīng)光密度儀掃描分析,以β-actin吸光度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正,計(jì)算APN產(chǎn)物的相對量。

6心肌細(xì)胞APN蛋白表達(dá)水平的檢測

裂解液裂解細(xì)胞后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。利用水浴式電印跡法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下封閉4 h后，加入兔抗APN多克隆抗體稀釋液，4 ℃ 過夜，用含體積分?jǐn)?shù)為0.5% Tween-20的PBS緩沖液(TPBS)洗3遍，再加入熒光染料標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000，Rockland IRDye800CW)Ⅱ抗稀釋液，37 ℃振搖1 h后用TPBS液洗3遍，用Odyssey9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器掃描PVDF膜后用成像分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算每組與β-actin表達(dá)量的比值。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1葡萄糖濃度小于30 mmol/L組，心肌細(xì)胞APN mRNA表達(dá)隨葡萄糖濃度的增加而減低(P<0.05)。30 mmol/L組和50 mmol/L組比較，APN mRNA表達(dá)無顯著差異。高滲組與相同糖濃度的5.5 mmol/L組比較APN mRNA表達(dá)無顯著差異,見圖1、表1。胰島素濃度小于10-7mmol/L組，心肌細(xì)胞APN mRNA表達(dá)隨胰島素濃度的增加而減低(P<0.05)。10-7mmol/L組和10-6mmol/L組比較，APN mRNA表達(dá)無顯著差異，見圖2、表2。

Figure 1. The expression of APN mRNA in cardiomyocytes treatd with different concentration glucose.

表1 不同糖濃度刺激下心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的變化

表2 不同胰島素濃度刺激下心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的變化

2葡萄糖濃度小于30 mmol/L組，心肌細(xì)胞APN蛋白表達(dá)隨葡萄糖濃度的增加而減低(P<0.05)。30 mmol/L組和50 mmol/L組比較，APN表達(dá)無顯著差異。高滲組與相同糖濃度的5.5 mmol/L組比較，APN蛋白表達(dá)無顯著差異，見圖3、表1。胰島素濃度小于10-7mmol/L組，心肌細(xì)胞APN蛋白表達(dá)隨胰島素濃度的增加而減低(P<0.05)。10-7mmol/L組和10-6mmol/L組比較，APN蛋白表達(dá)無顯著差異，見圖4、表2。

Figure 3. The expression of APN protein in cardiomyocytes treated with glucose at different concentrations.

Figure 4. The expression of APN protein in cardiomyocytes treated with insulin at different concentrations.

討 論

脂聯(lián)素的表達(dá)受一系列激素和環(huán)境因素影響：糖皮質(zhì)激素、β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑、腫瘤壞死因子(TNF-α)使脂聯(lián)素表達(dá)下降；體重減輕、寒冷刺激、腎上腺切除、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、胰島素增敏劑噻唑烷二酮使脂聯(lián)素表達(dá)增加。脂聯(lián)素具有調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝、改善胰島素抵抗、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎等生物活性[3，4]。脂聯(lián)素在健康機(jī)體血漿中含量豐富，但在冠心病、肥胖、2型糖尿病及原發(fā)性高血壓等疾病狀態(tài)下，脂聯(lián)素水平下降，且其下降程度與病情嚴(yán)重程度相關(guān)[5,6]。

血漿中的脂聯(lián)素主要由脂肪細(xì)胞分泌。糖尿病狀態(tài)下循環(huán)脂聯(lián)素濃度的變化主要由脂肪細(xì)胞分泌脂聯(lián)素量的變化決定。有研究認(rèn)為[7-9]，一定范圍內(nèi)的高濃度葡萄糖或者胰島素可使脂肪細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素下降。脂聯(lián)素下調(diào)可能和高糖、高胰島素狀態(tài)或胰島素抵抗有關(guān)。葡萄糖以劑量依賴方式降低基礎(chǔ)和胰島素刺激的葡萄糖攝取率。暴露于高糖環(huán)境中的脂肪細(xì)胞可以出現(xiàn)胰島素抵抗，葡萄糖攝取下降，脂聯(lián)素表達(dá)減低。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病患者的血漿脂聯(lián)素濃度明顯高于體重指數(shù)(BMI)相匹配的正常對照組，并且在胰島素治療前后，1型糖尿病患者血漿脂聯(lián)素濃度沒有顯著變化。有學(xué)者[10]用高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)形成受試者血糖濃度保持不變的單純高胰島素血癥模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與基礎(chǔ)胰島素濃度相比，受試者的血漿脂聯(lián)素濃度顯著下降。Pattaranit等[11]研究表明TZD治療組的胰島素敏感性、脂聯(lián)素表達(dá)和分泌較二甲雙胍治療組增加，且雙胍治療組對脂聯(lián)素濃度沒有影響，2組患者治療后的血糖下降無差異。因此認(rèn)為高血糖可能不是脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)改變的決定因素。胰島素抵抗或胰島素濃度可能是主要因素，高血糖對血漿脂聯(lián)素的作用可能是通過胰島素抵抗或其它影響因素介導(dǎo)的。

目前，關(guān)于脂聯(lián)素的研究多集中在脂肪細(xì)胞中。近期人們發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素還可在肝細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞表達(dá)。那么心肌細(xì)胞是否表達(dá)脂聯(lián)素？高血糖和高胰島素血癥狀態(tài)下對心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)有何影響，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究通過差速貼壁法進(jìn)行乳鼠心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)，最終檢測心肌細(xì)胞的脂聯(lián)素表達(dá)。正常大鼠血糖波動(dòng)于3.0-6.0 mmol/L，本實(shí)驗(yàn)以5.5 mmol/L組模擬正常糖環(huán)境，以20、25、30、50 mmol/L組分別模擬不同濃度的高葡萄糖病理狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 5.5 mmol/L葡萄糖組的脂聯(lián)素表達(dá)顯著高于20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L組，說明正常糖環(huán)境中心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)較高，而隨葡萄糖濃度的增加，心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)下降，但是30 mmol/L組與50 mmol/L組的脂聯(lián)素表達(dá)無顯著差異。說明高糖在一定范圍內(nèi)下調(diào)心肌細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素，但超過這一范圍，脂聯(lián)素表達(dá)不再符合此趨勢。高滲組的脂聯(lián)素表達(dá)與5.5 mmol/L組無顯著差異，但明顯高于50 mmol/L組，說明高糖對于心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的影響是糖濃度造成的，而非滲透壓。正常大鼠血漿胰島素空腹波動(dòng)于10-10mol/L上下，餐后升高5-6倍。本實(shí)驗(yàn)以10-10mol/L組模擬正常糖環(huán)境，說明高濃度胰島素環(huán)境中，心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)下調(diào)，并且在一定限度內(nèi)，隨胰島素濃度遞增脂聯(lián)素表達(dá)遞減，但是超過這一范圍，脂聯(lián)素表達(dá)不再明顯下降。

本實(shí)驗(yàn)首次證明了高葡萄糖、高胰島素下調(diào)心肌細(xì)胞脂聯(lián)素的表達(dá)。有研究表明，2型糖尿病患者脂聯(lián)素表達(dá)過低可能與高胰島素狀態(tài)下MAPK功能失調(diào)有關(guān)，p42/p44MAPK的抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)胰島素抑制脂聯(lián)素表達(dá)的效應(yīng)[12]。在高糖、高胰島素狀態(tài)下，心肌細(xì)胞是通過何種分子機(jī)制下調(diào)脂聯(lián)素表達(dá)的，仍有待進(jìn)一步探討。

[1] Ferrarezi DA, Cheurfa N, Reis AF, et al. Adiponectin gene and cardiovascular risk in type 2 diabetic patients: a review of evidences[J]. Arq Bras Endocrinol Metabol, 2007,51(2):153-159.

[2] Kadowaki T, Yamauchi T, Kubota N, et al. Adiponectin and adipinectin receptors in insulin resistance, diabetes, and the metabolic syndrome[J]. J Clin Invest, 2006,116(7):1784-1792.

[3] 廖文強(qiáng),龐 燕,張翼冠,等.脂聯(lián)素抗人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用研究[J].中國病理生理雜志,2009,25(3):456-459.

[4] 冉建民,勞干誠,張 揚(yáng),等.兩種不同胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的大鼠高脂聯(lián)素血癥產(chǎn)生的機(jī)制研究[J].中國病理生理雜志,2009,25(3):529-535.

[5] Yamauchi T, Kamon J, Waki H, et al. The fat derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity[J]. Nat Med, 2001, 7(8): 941-946.

[6] Hotta K, Funahashi T, Bodkin NL, et al. Circulating concentrations of the adipocyte protein adiponectin are decreased in parallel with reduced insulin sensitivity during the progression to type 2 diabetes in rhesus monkeys[J]. Diabetes, 2001,50(5):1126-1133.

[7] 俞利紅, 谷 衛(wèi). 不同葡萄糖濃度對3T3-L1細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)的影響[J]. 浙江醫(yī)學(xué), 2005, 27(12): 901-902.

[8] Yamauchi T, Kadowaki T. Physiological and pathophysiological roles of adiponectin and adiponectin receptors in the integrated regulation of metabolic and cardiovascular diseases[J]. Int J Obes(Lond)，2008, 32(Suppl 7):S13-S18.

[9] Han SH, Sakuma L, Shin EK, et al. Antiatherosclerotic and anti-insulin resistance effects of adiponectin: basic and clinical studies[J]. Prog Cardiovasc Dis, 2009, 52(2):126-140.

[10]鄧宏明，劉 紅，鄧華聰，等. 羅格列酮改善2型糖尿病患者體脂分布、脂聯(lián)素水平和組織胰島素敏感性[J]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志, 2005,21(3): 233-236.

[11]Pattaranit R, van den Berg HA, Spanswick D. The development of insulin resistance in type 2 diabetes: insights from knockout studies [J]. Sci Prog, 2008, 91(Pt3): 285-316.

[12]Haugen E, Furukawa Y, Isic A, et al. Increased adiponectin level in parallel with increased NT-pro BNP in patients with severe heart failure in the elderly: A hospital cohort study[J]. Int J Cardiol, 2008, 125(2): 216-219.

Influenceofglucoseandinsulinonexpressionofadiponectioninneonatalratcardiomyocytes

WANG Mei, YANG Rong, WANG Ya-ling, LIU Jin-ming, LI Yong-jun, ZHANG Hui, QI Zhao

(DepartmentofCardiology,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China.E-mail:lyjbs2009@yeah.net)

AIM: To study the influence of glucose or insulin at different concentrations on the expression of adiponectin in cardiomyocytes.METHODSMyocardial cells were isolated from the hearts of neonatal Sprague-Dawley rats and primarily cultured. The cells stimulated with glucose at concentrations of 5.5, 20, 25, 30, and 50 mmol/L respectively were divided into 5 groups and a hypertonic control group was set up. The cells treated with insulin at concentrations of 0, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7and 10-6mol/L were also divided into 6 groups. The mRNA and protein levels of adiponectin(APN) were determined by RT-PCR and Western blotting 48 h after the intervention with glucose or insulin.RESULTS(1) The expression of adiponectin decreased with the elevation of glucose concentration at the doses lower than 30 mmol/L(P<0.05). When higher than 30 mmol/L, the expression of adiponectin didn’t change significantly. The osmotic pressure did not affect the adiponectin expression in cardiomyocytes.(2) The expression of adiponectin decreased with the elevation of insulin concentration at the doses lower than 10-7mmol/L(P<0.05). When higher than 10-7mmol/L, the expression of adiponectin didn’t change significantly.CONCLUSIONThe expression of APN decreases with the elevation of glucose or insulin concentrations within a certain range of dosage.

Cardiomyocytes; Adiponectin; Glucose; Insulin; Rats

R322.1+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-030

1000-4718(2011)02-0371-04

2010-07-26

2010-11-17

△通訊作者 Tel: 0311-66002173; E-mail:lyjbs2009@yeah.net