武漢漢族新生兒中肺表面活性物質蛋白D基因多態性及其與支氣管肺發育不良相關性分析*

周玉容， 常立文， 李文斌， 劉 偉， 曾凌空， 張 佳， 單瑞艷， 潘 睿

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院兒科,湖北 武漢 430030)

武漢漢族新生兒中肺表面活性物質蛋白D基因多態性及其與支氣管肺發育不良相關性分析*

周玉容， 常立文△， 李文斌， 劉 偉， 曾凌空， 張 佳， 單瑞艷， 潘 睿

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院兒科,湖北 武漢 430030)

目的： 研究武漢漢族新生兒中肺表面活性物質蛋白D(SP-D)基因多態性及其與支氣管肺發育不良(BPD)易感性的相關關系。方法采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)對218例武漢漢族新生兒SP-D相關位點進行基因型檢測,同時進行基因測序驗證結果。結果SP-DMet11Thr三種基因型TT、TC、CC頻率分別為10.5％、49.1％、40.4％，等位基因T和C頻率分別為35.1％和64.9％。SP-DAla160Thr三種基因型GG、GA、AA頻率分別為54.6％、39.4％、6.0％，等位基因G和A頻率分別為74.3％和25.7％。與對照組比，SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態性與BPD發生率無明顯關聯(Pgt;0.05)。結論SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型和等位基因頻率存在種族差異性；SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態性與BPD發生率無明顯關聯。

肺表面活性物質蛋白D； 等位基因； 基因型； 基因多態性； 支氣管肺發育不良

肺表面活性物質(pulmonary surfactant,PS)分布于肺泡液體分子層表面，具有降低肺泡表面張力防止呼氣時肺泡塌陷的作用。肺表面活性物質由肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌，它由磷脂和肺表面活性蛋白(surfactant proteins，SPs)組成。肺表面活性物質蛋白包括SP-A、SP-B、SP-C、SP-D。其中SP-D屬于C型凝集素家族，同SP-A一樣是肺組織天然免疫的重要組成部分，而且它可以調節肺的炎癥過程[1]。SP-D除了在肺部炎癥和感染過程中起重要作用外，它還參與了肺表面蛋白的調節過程[2]。鑒于SP-D在維持肺組織功能方面的作用，它是研究新生兒肺疾病很好的候選基因[3]。SP-D基因研究得較多的是氨基酸殘基11密碼子(SP-DMet11Thr)和氨基酸殘基160密碼子(SP-DAla160Thr)的多態性[4]。SP-DMet11Thr 多態性與血清SP-D水平相關且T等位基因與較高的SP-D水平相關，SP-D水平80％由遺傳因素決定，Met11Thr多態性在其中起了一半決定作用[5]。SP-D外顯子5上基因多態性位點SP-DAla160Thr可導致SP-D氨基酸的改變，最新研究證明它的多態性還與潰瘍性結腸炎相關[6]。

支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是長時間機械通氣早產兒的常見病因。近年來隨著早產兒存活率升高，BPD發病率呈上升趨勢。BPD是一種多因素疾病，其本質是在遺傳易感性的基礎上,氧中毒、氣壓傷、容量傷以及感染或炎癥等各種不利因素對發育不成熟的肺組織所導致的損傷,及其異常修復[7，8]。本研究以武漢漢族新生兒為研究對象，探討了武漢新生兒SP-D等位基因頻率分布。同時采用隨機病例-對照研究方法探討了SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態性與BPD發生的關系。

材 料 和 方 法

1研究對象

選擇2008年7月至2010年5月就診同濟醫院的武漢地區漢族新生兒218例，其中男138例，女80例。所有符合BPD診斷[8]患兒共32例(男22例，女10例)選為病例組。BPD最重要的流行病因素是小胎齡和低出生體重[9]，我們對BPD胎齡和出生體重進行統計學分析發現胎齡lt;35周，出生體重均在2 kg以下。因此我們以胎齡﹤35周，出生體重﹤2 kg非BPD患兒64例為對照組(男48例，女16例)，并排除致死性先天畸形、嚴重的先天性心臟病等疾病。另外對照組存活均≥28 d。本研究由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院倫理委員會批準并獲得研究對象父母的知情同意。

2方法

2.1標本采集及基因組DNA抽提 抽取EDTA或肝素抗凝血0.5 mL，-20 ℃保存，用以提取基因組DNA。DNA抽提采取傳統的酚氯仿抽提法。抽提步驟如下：凍存血自然解凍后加等量磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，3 000 r·min-1離心15 min;棄上清，加細胞裂碎液150 μL，37 ℃水浴60 min后加20％十二烷基硫酸鈉(SDS)25 μL和蛋白酶K 20 μL，37 ℃水浴過夜；次日取消化的細胞液按3∶1加酚氯仿異戊醇混勻，3 000 r·min-1離心10 min；酚氯仿異戊醇重復抽提1次；取上層加冰無水乙醇800 μL和醋酸鈉15 μL使DNA沉淀，70％乙醇洗滌后加TE緩沖液(Tris-EDTA)20 μL溶解DNA；-20 ℃保存備用。

2.2聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)和基因測序 采用PCR技術，引物設計按文獻[10]。引物對中設計了錯配堿基(下劃線標出，見表1)，用以導入限制性內切酶識別位點。PCR反應體系20 μL，含10 μL 2×PCR PLUS MIX(DBI)，1.2 μL DNA模板，上、下游引物各0.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共45個循環。72 ℃終末循環10 min。PCR擴增產物6 μL分別用FspⅠ(Toyobo)DraⅢ(NEB)酶切，反應體系15 μL，含FspⅠ、DraⅢ酶各4 U、5 U，37 ℃消化過夜。取5 μL酶消化產物和3 μL 6×上樣緩沖液進行瓊脂糖凝膠(濃度3％)電泳分離，紫外光下觀察并照相。參照DNA分子量標準(TaKaRa DL500 DNA marker)根據電泳條帶位置判斷基因型。上述PCR擴增產物隨機抽取部分送華大基因進行測序驗證，測序引物由華大基因設計，見表1。

表1 SP-D引物序列、限制性內切酶和酶切后片段長度及測序引物

3統計學處理

通過基因型頻率計算等位基因頻率，以Hardy-Weinberg平衡檢驗確認樣本的群體代表性。武漢新生兒基因型以及基因頻率分布的比較采用Pearson2檢驗。BPD組與對照組基因型及等位基因頻率比較分別用Fisher確切概率法。Plt;0.05 為顯著差異。Hardy-Wenberg平衡檢驗、基因頻率、等位基因頻率比較用Popgene 1.31統計軟件進行分析。其它數據分析采用 SPSS 11.5 for Windows 統計軟件。

結 果

1SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因分型

SP-DMet11Thr基因經PCR擴增產物大小為139 bp。經FspⅠ酶切后產生3種基因型，其基因型和對應酶切后長度為: CC(139 bp)、TC (107 bp、139 bp)和 TT(107 bp)。SP-DAla160Thr基因經PCR擴增產物大小為161 bp。經DraⅢ酶切后產生 3 種基因型，其基因型和對應酶切后長度為： GG(161 bp)、GA(132 bp、161 bp)、AA(132 bp)。PCR-RFLP檢測SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因分型結果與直接DNA測序結果完全吻合。

2武漢漢族新生兒SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型及等位基因頻率分布

選擇2008年7月至2010年5月就診同濟醫院的武漢地區漢族新生兒218例進行基因型的檢測。經Hardy-Weinberg平衡檢驗人群基因型達到遺傳平衡(Pgt;0.05)，具有群體代表性。SP-DMet11Thr三種基因型TT、TC、CC頻率分別為10.5 ％、49.1 ％、40.4 ％，等位基因T頻率為35.1 ％，等位基因C頻率為64.9 ％。SP-DAla160Thr三種基因型GG、GA、AA頻率分別為54.6 ％、39.4 ％、6.0 ％，等位基因G頻率74.3 ％，等位基因A頻率25.7 ％。

3不同國家地區SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因多態性分布的比較

我們比較了不同國家SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型和等位基因頻率。SP-DMet11Thr等位基因T頻率德國人為62.2 ％[4]，墨西哥人為61.0 ％[11]，日本人為41.2 ％[6]，漢族新生兒(本例對照)為34.0 ％。SP-DAla160Thr等位基因G在德國人為40.0 ％[4]，墨西哥人為60.0％[11]，日本人為68.4 ％[6]，而中國人為80.0 ％。不同國家SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型見表2。從表2可見本研究對照組基因型頻率與日本人較接近。武漢新生兒與其他3種群基因型及等位基因頻率Pearson2檢驗顯示：武漢新生兒等位基因頻率與德國人、墨西哥人及日本人相比有顯著差異(Plt;0.05)；武漢新生兒基因型頻率與德國人和墨西哥人相比有顯著差異(Plt;0.05)，與日本人比差異不明顯(Pgt;0.05)。

4SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr多態性與BPD發生的關系

BPD與對照組在性別構成、胎齡、出生體重等方面無顯著差異(Pgt;0.05)。SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型頻率和等位基因頻率在BPD和對照組中差異無統計學意義(Pgt;0.05)，見表3。

表3 BPD組和對照組SP-D Met11Thr 和SP-D Ala160Thr基因型及等位基因頻率分布

討 論

編碼SP-D的基因位于人類10號染色體的長臂q22.2-23.1區域，編碼SPA的基因也位于10號染色體長臂上。本文研究的多態性位點SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr在SP-D氨基酸末端和膠原結合區域。

我們對不同國家地區SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因多態性的比較結果，進一步證實SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因型和等位基因頻率存在種族差異性。大部分關于SP-D基因多態性與疾病的相關性主要在肺部疾病方面，尤其是肺部感染。眾多嚴重慢性和炎癥性肺部疾病存在SP-D血清水平升高現象，如間質性肺炎、特發性肺纖維化、肺泡蛋白沉積癥、嗜酸性肺炎、急性呼吸窘迫綜合癥和囊性纖維化等[10,12]。已證實SP-DThr11等位基因是結核病的易感基因[13]，在此位點上的另一個等位基因SP-DMet11與嚴重呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎相關[11]。研究SP-DMet11Thr 和SP-DAla160Thr基因多態性種族差異性有利于了解某些疾病(尤其是SP-D相關性疾病)在某些種族中的易感性，從而有利于采取針對性的預防措施并最終找到治療方法(如基因治療,其已在積極研究中[14])。

而關于SP-D基因多態性與BPD關聯研究較少，目前國內尚無此類報道。國外有家系研究顯示單倍體型SPD-160(G)SPA2(1A2)和SPD-11(C)160(G)SPA2(1A2)是BPD保護性基因[15]。本研究結果顯示SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr基因型頻率和等位基因頻率在BPD和對照組中差異無統計學意義(Pgt;0.05)。鑒于本研究樣本量較小,且SP-D基因存在種族或地域差異性，本研究并不能完全確定SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr與BPD發生無關。因此下一步有必要擴大樣本量進行研究，如有條件還可采用更加嚴格的家系或雙胎研究分析，以進一步明確SP-DMet11Thr和SP-DAla160Thr多態性與BPD的發生之間是否存在相關。

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PolymorphismsofsurfactantproteinDandassociationbetweenpolymorphismsandbronchopulmonarydysplasiainHanracialWuhannewborns

ZHOU Yu-rong,CHANG Li-wen,LI Wen-bin,LIU Wei,ZENG Ling-kong,ZHANG Jia,SHAN Rui-yan,PAN Rui

(DepartmentofPediatrics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:lwchang@tjh.tjmu.edu.cn)

AIM: To analyze the genetic polymorphisms of surfactant protein D (SP-D) and to investigate the association between polymorphisms and bronchopulmonary dysplasia (BPD) in Han racial Wuhan newborns.METHODSGenotyping ofSP-Dpolymorphisms was performed by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis (PCR-RFLP) in 218 Han racial Wuhan newborns.The method of gene sequencing was used to validate the results.RESULTSThe frequencies of TT,TC,CC ofSP-DMet11Thr were 10.5％,49.1％ and 40.4％,respectively,and the allele frequencies of T and C were 35.1％ and 64.9％,respectively.The frequencies of GG,GA,AA ofSP-DAla160Thr were 54.6％,39.4％ and 6.0％,respectively,and the allele frequencies of G and A were 74.3％ and 25.7％.SP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr displayed no significant association with BPD as compared with control group.CONCLUSIONThe differences inSP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr polymorphisms are significant among several ethnic groups.Polymorphisms ofSP-DMet11Thr andSP-DAla160Thr display no significant association with BPD as compared with control group.

Pulmonary surfactant-associated protein D； Alleles； Genotype； Gene polymorphism; Bronchopulmonary dysplasia

1000-4718(2011)05-0968-04

R363; R722

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.025

2010-11-23

2011-02-20

國家自然科學基金資助項目(No.30872795)；湖北省自然科學基金資助項目(No.2008CDB139)；新教師基金資助項目(高等學校博士學科點專項科研基金，No.200804871058)

△ 通訊作者 Tel：027-83663345;E-mail：lwchang@tjh.tjmu.edu.cn