米諾環素抑制MPP+ 誘導的PC12 細胞凋亡和線粒體功能損傷*

樂 亮， 李晶潔， 黎仕鋒， 朱文博， 束敏峰， 蘇興文， 邱鵬新， 顏光美

(中山大學中山醫學院藥理學教研室，廣東 廣州510082)

帕金森病(Parkinson diseases，PD)是一種常見的慢性神經系統性疾病。PD 以運動減少、肌張力強直和震顫為主要癥狀;以中腦黑質致密區多巴胺能神經元進行性缺失并伴有Lewy 小體生成為主要病理特征［1－3］。長期以來，研究者針對神經元的壞死和凋亡，期望開發一種有效的神經保護劑。近幾年來，人們發現四環素的衍生物－ 米諾環素(minocycline)具有顯著的抗炎、抗凋亡和抗氧化等作用，可能成為一種有效的多巴胺能神經元的保護劑［4－6］。本實驗以PC12 細胞為多巴胺能神經元模型，觀察米諾環素對1－甲基－4－苯基吡啶離子(1－methyl－4－phenylpyridinium ion，MPP+)誘導的PC12 細胞的線粒體功能損傷的保護作用，為米諾環素應用于PD的臨床治療提供理論基礎。

材 料 和 方 法

1 PC12 細胞培養及誘導分化

PC12 細胞(由中山大學中山醫學院藥理教研室提供)置于含10%馬血清(Gibco)和5%胎牛血清(Gibco)、1 ×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RMPI－1640(Gibco)培養基中，37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養。

傳代的PC12 細胞加入100 μg/L NGF，并培養在含膠原蛋白鋪板的細胞板內，經7－8 d 的誘導分化，長出突觸，用于實驗。誘導分化后的PC12 細胞分別先用終濃度為0、0.01、0.1、1、10 μmol/L minocycline預處理30 min，然后加入0.5 mmol/L 的MPP+，再置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養24 h，用于實驗。

2 甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測細胞活性

PC12 細胞按密度為1 ×108cells/L、100 μL/well接種于96 孔板。經誘導分化并給藥處理后，每孔加入5 g/L MTT(Sigma)溶液20 μL。37 ℃、5%CO2細胞培養箱放置4 h 后棄去培養基，加入二甲基亞砜(Sigma)100 μL。振蕩10 min 后，用酶標儀(BioTek，Burlington，VT)在570 nm 波長處測定各孔的吸光度值(A值)。最后按公式:細胞的存活率=(給藥組A 值/對照組A 值)×100%計算得出各組的細胞生存率。

3 Hoechst 染色檢測細胞凋亡

PC12 細胞經處理后，用4% 多聚甲醛固定10 min，使用5 mg/L Hoechst 33258 暗處染色15 min，在熒光顯微鏡下，以340 nm 的激發光波長觀察染色情況，并計算細胞核形態改變所占比例。

4 PC12 細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)的測定

DCFH－DA 本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH 不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH 生成有熒光的DCF。檢測DCF 的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。PC12 細胞經處理后，棄去培養基，96 孔板的細胞培養板中加入終濃度為10 μmol/L DCFH－DA(活性氧檢測試劑盒，碧云天)100 μL/well。37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，用無血清的培養基洗滌3 次，用多功能酶標儀(Infinite F500，奧地利)，以488 nm 的激發光、525 nm 的發射光測定每孔的熒光強度。以(給藥組/對照組)×100%的比率作為活性氧變化的指標。

5 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，Δψm)分析

JC－1 是一種廣泛用于檢測Δψm的理想熒光探針。可以檢測細胞的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC－1 聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，可以產生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時，JC－1 不能聚集在線粒體的基質中，此時JC－1 為單體，可以產生綠色熒光。常用綠紅熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例［7］。孵育在6 孔板的PC12 細胞經給藥處理24 h 后，去除培養基，加入等體積的JC－1(5 mg/L)，37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，用PBS 洗2 次。用激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss)，以激發光波長488 nm、發射光波長545 nm檢測綠紅熒光強度，以綠紅熒光強度比值反映線粒體膜電位的變化。

6 統計學處理

結 果

1 Minocycline 對PC12 細胞活性的影響

Figure 1. The protective effect of minocycline at 0. 1，1 and 10 μmol/L on decreased cell viability induced by 0.5 mmol/L MPP + in PC12 cells. PC12 cells were pretreated with 0.1，1 and 10 μmol/L minocycline for 30 min prior to 0.5 mmol/L MPP + treatment for 24 h，and then MTT assay was used to determine cell viability. ±s. n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control group;## P ＜0.01 vs MPP + group.圖1 不同濃度minocycline 預處理對MPP +誘導PC12 細胞活性下降的影響

由圖1 可知，0.5 mmol/L MPP+處理PC12 細胞24 h 后，80.8%的細胞生長被抑制，與不加任何處理的細胞比較差異顯著。而在用minocycline 預處理30 min 后，再用0.5 mmol/L MPP+處理，則PC12細胞的存活率明顯提高，并隨minocycline 濃度的升高有呈明顯劑量依賴性。Minocycline 的濃度0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 時，分別只有40.7%、28.8%、22.1%的細胞死亡，相對單用MPP+處理，分別提高了40.1%、54.0%、58.7%的細胞存活率。兩兩比較發現，給藥組分別與MPP+組相比，差異顯著(P ＜0.01)，說明minocycline 能明顯改善由MPP+引起的細胞活性下降。

2 Minocycline 對PC12 細胞凋亡的影響

如圖2 所示，在0.5 mmol/L MPP+處理24 h 后，PC12 細胞經Hoechst 染色可以明顯看到有凋亡現象發生，凋亡率為5.22%，與對照組的0.57%的凋亡率比較明顯升高;而經10 μmol/L minocycline 預處理30 min 再用0.5 mmol/L MPP+處理24 h，則PC12 細胞的凋亡數明顯減少，凋亡率僅為0.91%，與對照組接近。顯然，minocycline 預處理能明顯抑制MPP+引起的PC12 細胞凋亡。

Figure 2. Minocycline inhibited the apoptosis of PC12 cells induced by MPP +. A:the apoptotic morphological changes of PC12 cells were induced by MPP +，however，pretreatment with 10 μmol/L minocycline blocked these changes(×100);B:quantitative analysis of apoptotic cells. ±s.n=5. ＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs MPP + group.圖2 Minocycline 對PC12 細胞凋亡的影響

3 Minocycline 抑制MPP+ 誘導的PC12 細胞內ROS 聚集

如圖3 所示，0.5 mmol/L MPP+處理PC12 細胞24 h，能引起ROS 的大量聚集，與正常細胞比較增加230.0%，而預處理0.1、1、10 μmol/L minocycline 與正常組比較，ROS 分別只有143.7%、91.1%、93.8%，和MPP+組相比，都具有統計學差異(P ＜0.01)。表明minocycline 能明顯抑制MPP+誘導的PC12 細胞內ROS 聚集。

4 Minocycline 抑制MPP+引起的PC12 細胞線粒體膜電位去極化

線粒體去極化時，由于JC－1 進入線粒體內減少，不能形成聚集，致使綠/紅熒光強度的比例上升。在正常PC12 細胞中，綠/紅熒光強度比僅為0.38，見圖4，而用0.5 mmol/L MPP+處理24 h 后，綠/紅熒光強度比則迅速上升為11.95，線粒體迅速去極化。而minocycline 預處理30 min，再加入0.5 mmol/L MPP+則綠/紅熒光強度比降為6.72，與單用MPP+比較差異顯著，說明minocycline 抑制MPP+誘導的PC12 細胞線粒體膜電位去極化。但與正常組比較差異顯著(P ＜0.01)，說明用minocycline 預處理并不能完全阻斷MPP+誘導的線粒體膜電位去極化。

討 論

PD 是繼阿爾茨海默病之后影響老年人身心健康的第二大神經退行性功能障礙疾病［8］。PD 的平均發病年齡在55 歲，并隨年齡的增長，發病率從20/10 萬增長至120/10 萬。在65 歲以上人群中，PD 發病率最高達1%［2］。目前對于PD 的發病機制眾說紛紜［9］，有研究顯示，線粒體功能性障礙和氧化應激可能與PD 的發病有關［10，11］。

Figure 3. The inhibitory effect of minocycline at 0.1，1 and 10 μmol/L on intracellular ROS increasing induced by 0.5 mmol/L MPP + in PC12 cells. PC12 cells were pretreated with 0.1，1 and 10 μmol/L minocycline for 30 min prior to 0.5 mmol/L MPP + treatment for 24 h，and then DCFH－DA probe was used to determine intracellular ROS. ± s. n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs MPP + group.圖3 Minocycline 對PC12 細胞內ROS 產生的影響

Figure 4. Minocycline attenuated mitochondrial membrane potentials in PC12 cells induced by MPP +. A:photographs of JC－1 staining in the three groups(×400);B:quantitative analysis of the ratio of mitochondrial green fluorescence to red fluorescence among groups. ±s.n=5. ＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs MPP + group.圖4 Minocycline 對PC12 細胞線粒體膜電位的影響

Minocycline 是第二代四環素類抗生素，具有較高的脂溶性，能順利透過血腦屏障。近年來研究發現minocycline 具有抗凋亡和抗氧化的作用，因此本實驗通過MPP+誘導PC12細胞建立多巴胺神經元細胞凋亡和壞死模型，觀察minocycline 預處理的保護作用。PC12 細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞系，富含酪氨酸羥化酶、單胺氧化酶和兒茶酚胺氧位甲基轉移酶，通過NGF 誘導產生突觸，具有神經分泌細胞和神經元的性質。因此PC12 細胞被廣泛用于PD 的研究。

MPP+是建立PD 細胞模型的常用工具藥，能誘導線粒體功能障礙和氧自由基生成增加。本實驗用0.5 mmol/L MPP+處理細胞24 h 后，MTT 檢測細胞活性，80.8%的細胞死亡，而Hoechst 染色計數顯示5.22%的細胞發生凋亡，說明0.5 mmol/L MPP+處理PC12 細胞24 h，既能誘導凋亡，也可導致細胞壞死，且細胞壞死占多數。本實驗發現，minocycline 預處理30 min，可明顯改善細胞活性，并具有劑量依賴性，在給以10 μmol/L minocycline 時，細胞存活率最大，為77.9%。這與Lin 等［12］的研究相符。同時，細胞凋亡從5.22%降到0.91%，說明minocycline 具有顯著保護PC12 細胞凋亡的作用，但目前對其抗凋亡機制尚無定論。Zhu 等［13］研究表明minocycline 可以抑制線粒體通透性轉換介導(permeability transition－ mediated)的細胞色素C 的釋放，從而抑制caspase－1 和caspase－3 介導的細胞凋亡，延緩肌萎縮性側索硬化小鼠的病情進展。

線粒體內膜分布著大量質子泵，其功能是將基質內質子H+泵入外室，從而形成橫跨內膜的ΔΨm，以維持線粒體的正常功能。ΔΨm的結構基礎是線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore)，其開放需要Ca2+的參與。使用MPP+處理后，線粒體復合物I 活性下降，線粒體基質內氧化磷酸化反應減少，ATP 產生減少，H+生成受抑制，其ΔΨm發生改變，線粒體膜電位去極化，pH 值升高，最終導致細胞死亡。N－methyl－D－aspartate (NMDA)受體功能可能與MPP+介導的神經毒性有關［14］，而minocycline 能夠抑制NMDA 介導的神經毒性［12］。本實驗發現minocycline 能夠抑制MPP+誘導的線粒體膜電位去極化，從而保護細胞。

［1］ Pereira EA，Aziz TZ . Parkinson's disease and primate research:past，present，and future［J］. Postgrad Med J，2006，82 (967):293－299.

［2］ Dauer W，Predborskis S. Parkinson's disease:mechanisms and models［J］.Neuron，2003，39(6):889－909.

［3］ Thomas B，Beal MF. Parkinson's disease［J］. Hum Mol Genet，2007，16 (2):R183－R194.

［4］ Du Y，Ma Z，Lin S，et al. Minocycline prevents nigrostriatal dopaminergic neurodegeneration in the MPTP model of Parkinson's disease［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(25):14669－14674.

［5］ Kikuchi K，Kawahara K，Biswas KK，et al. Minocycline attenuates both OGD－induced HMGB1 release and HMGB1－induced cell death in ischemic neuronal injury in PC12 cells［J］. Biochem Biophys Res Commun，2009，385(2):132－136.

［6］ Wang J，Wei Q，Wang CY，et al. Minocycline up－regulates Bcl－2 and protects against cell death in mitochondria［J］. J Biol Chem，2004，279(19):19948－19954.

［7］ Wang Z，Tang X，Li Y，et al. 20－Hydroxyeicosatetraenoic acid inhibits the apoptotic responses in pulmonary artery smooth muscle cells［J］. Eur J Pharmacol，2008，588(1):9－17.

［8］ de Lau LM，Breteler MM . Epidemiology of Parkinson's disease［J］. Lancet Neurol，2006，5 (6):525－535.

［9］ 康君芳，張寶榮，尹厚民，等.經顱磁刺激對帕金森氏病患者的運動誘發電位的研究［J］. 中國病理生理雜志，2009，25(4):725－728.

［10］ Shults CW. Mitochondrial dysfunction and possible treatments in Parkinson's diseases:a review［J］. Mitochondrion，2004，4(5－6):641－648.

［11］ Batandier C，Leverve X，Fontaine E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I ［J］. J Biol Chem，2004，279(17):17197－17204 .

［12］ Lin S，Wei X，Xu Y，et al. Minocycline blocks 6－hydroxydopamine－induced neurotoxicity and free radical production in rat cerebellar granule neurons［J］. Life Science，2003，72(14):1635－1641.

［13］ Zhu S，Stavrovskaya IG，Drozda M，et al. Minocycline inhibits cytochrome c release and delays progression of amyotrophic lateral sclerosis in mice［J］. Nature，2002，417(6884):74－78.

［14］ Church WH，Hewett SJ. Relationship between NMDA receptor expression and MPP+toxicity in cultured dopaminergic cells［J］. J Neurosci Res，2003，73(6):811－817.