去卵巢骨質疏松模型大鼠骨組織CGRP及其1型受體的表達*

呂辰鵬， 楊 麗， 孫 影， 方 霽， 奉水旺， 粱 恒， 李淑琴， 張榮華△

(暨南大學1藥學院中藥學教研室，2醫學院中醫系，廣東 廣州 510632)

去卵巢骨質疏松模型大鼠骨組織CGRP及其1型受體的表達*

呂辰鵬1， 楊 麗1， 孫 影1， 方 霽2， 奉水旺1， 粱 恒2， 李淑琴1， 張榮華1△

(暨南大學1藥學院中藥學教研室，2醫學院中醫系，廣東 廣州 510632)

目的： 觀察去卵巢骨質疏松(OP)模型大鼠骨組織降鈣素基因相關肽(CGRP)及其1型受體(CGRPR1)的表達。方法將30只3月齡Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠隨機分成假手術組(15只)和模型組(15只)。采用雙側卵巢切除術復制OP大鼠模型。去卵巢12周后，應用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)觀察各組大鼠股骨CGRP和CGRPR1 mRNA的表達；應用免疫組織化學技術觀察各組大鼠股骨遠端干骺端CGRP和CGRPR1蛋白的表達。結果模型組大鼠股骨CGRP和CGRPR1 mRNA的表達較假手術組顯著降低(Plt;0.01)；模型組大鼠股骨遠端干骺端CGRP和CGRPR1蛋白的表達較假手術組顯著降低(Plt;0.01)。結論骨組織CGRP及CGRPR1表達的減少可能是OP形成的機制之一。

降鈣素基因相關肽； 骨質疏松； 卵巢切除術

降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在脊椎動物的骨組織廣泛存在[1]，對骨代謝起著重要的調節作用[2,3]。本實驗通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和免疫組織化學技術觀察去卵巢骨質疏松模型大鼠骨組織CGRP及CGRP1型受體(calcitonin gene-related peptide type 1 receptor,CGRPR1)表達的變化，探討CGRP在骨質疏松癥(osteoporosis,OP)發展過程中的作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 清潔級(SPF)3月齡SD(Sprague-Dawley)雌性大鼠30只，體重(242.0±12.0)g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(粵)2008-0002。

1.2主要儀器 Prodigy型雙能X線骨密度儀(Lunar)，2-16K型臺式高速冷凍離心機(Sigma)，Veriti 96孔多重控溫梯度PCR儀(ABI)，GEL EQ凝膠成像系統(Bio-Rad)，奧林巴斯顯微鏡(Olympus)，輪轉切片機(Shandon)。

1.3主要試劑 CGRP兔抗鼠多克隆抗體(Abcam)，CGRPR1兔抗鼠多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒(均購自武漢博士德生物工程有限公司)，ReverTra Dash RT-PCR Kit(Toyobo)等。

2方法

2.1實驗動物分組及模型復制 30只3月齡SD雌性大鼠，隨機分為模型組(15只)和假手術組(15只)。模型組大鼠行雙側卵巢切除術[4,5]，假手術組大鼠打開腹腔，找到卵巢，但不切除。

2.2標本的制備 2組大鼠于手術12周后進行雙能X線骨密度檢測，確定造模成功后處死。2％戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，開胸，暴露心臟，心臟采血后，依次灌注200-250 mL生理鹽水和350-400 mL 4％多聚甲醛。灌注完畢后，迅速取左側股骨，用DEPC水處理后，包裹密封置液氮中保存，用于RT-PCR實驗。取出右側股骨，置4％多聚甲醛中4 ℃固定24 h。取出后置20％EDTA溶液中4 ℃脫鈣[6]，3 d換液1次，直至大頭針能順利刺入骨組織。常規脫水，透明，浸蠟，包埋，選擇遠端干骺端切成4 μm厚的連續切片，貼片于防脫玻片，用于免疫組織化學染色。

2.3逆轉錄聚合酶鏈式反應

① 總RNA的提取 采用Trizol一步法提取總RNA。

② 引物的設計 以管家基因G3PDH為內參照。G3PDH引物由東洋紡(上海)生物科技有限公司提供，基因序列為：上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。CGRP和CGRPR1特異性引物設計參照文獻[7,8]，由上海捷瑞生物技術有限公司合成，基因序列為：CGRP上游引物5′-AAGTTCTCCCCTTTCCTGGT-3′，下游引物5′-GGTGGGCACAAAGTTGTCCT-3′；CGRPR1上游引物5′-TGCTCTGTGAAGGCATTTAC-3′，下游引物5′-CAGAATTGCTTGAACCTCTC -3′。

③ 第一鏈cDNA的合成 反應體系20 μL：RNase-free H2O 10 μL，random primer(25 μmol/L) 1 μL，Total RNA 1 μL，5×RT buffer 4 μL，dNTP mixture(10 mmol/L) 2 μL，RNase inhibitor(1×107U/L) 1 μL，ReverTra Ace 1 μL。反應條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，99 ℃5 min，4 ℃ 5 min，1個循環。產物于-20 ℃冰箱保存備用。

④ PCR反應 總反應體系為100 μL：第一鏈cDNA 20 μL，RNase-free ddH2O 67 μL，10×PCR buffer 10 μL，序列特異性上游引物(10 μmol/L)1 μL，序列特異性下游引物(10 μmol/L)1 μL，KOD Dash 1 μL。G3PDH擴增條件：98 ℃ 10 s，60 ℃ 2 s，74 ℃ 30 s，33個循環。CGRP擴增條件：94 ℃ 10 s，52 ℃ 2 s，74 ℃ 30 s，33個循環。CGRPR1擴增條件：94 ℃ 10 s，45 ℃ 2 s，74 ℃ 30 s，33個循環。

⑤ PCR產物分析 PCR反應結束后取反應液10 μL進行2％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后用凝膠成像系統拍照并對電泳條帶進行分析。目的基因條帶灰度值與G3PDH條帶的灰度值之比作為目的基因mRNA 的表達水平參數。

2.4免疫組織化學染色

① 免疫組織化學染色步驟 切片常規烤片，脫蠟至水，進行SABC染色。具體步驟如下：3％H2O2室溫孵育10 min；0.1％胰蛋白酶37 ℃修復抗原10 min；5％BSA室溫封閉20 min；滴加Ⅰ抗(CGRP：1∶200；CGRPR1：1∶50)4 ℃過夜；第2 d復溫至室溫，滴加Ⅱ抗工作液37 ℃孵育20 min；滴加SABC 37 ℃20 min；滴加DAB 顯色劑，顯微鏡下觀察控制反應時間。以上步驟間均用0.2 mol/L PBS(pH=7.2)緩沖液洗滌5 min × 3次。蘇木素復染，常規脫水，透明，封片。

② 陽性標記的分析及數據的采集 每張切片均在光學顯微鏡下(×200)分析陽性標記的分布情況，隨機選取5個視野觀察并拍照。應用Image-Pro Plus 6.0醫學圖像分析軟件(Media Cybernetics)對表達結果進行半定量分析[9]，測量免疫陽性部位的平均吸光度值(absorbance value,A)，并以mean density作為免疫反應強度的參數。

3統計學處理

結 果

1總RNA的檢測

總RNA的1％瓊脂糖凝膠電泳條帶在紫外燈下觀察為3條帶,見圖1，分別為28 S、18 S、5 S，且各條帶清晰拖尾輕，說明其質量和豐度均很高。在紫外分光光度計下檢測各組RNA的A260/A280值均介于1.8-2.0之間，說明其純度較高。

22組大鼠股骨CGRPmRNA的表達

RT-PCR檢測表明，CGRP擴增產物為370 bp,見圖2；2組CGRP目的基因條帶和G3PDH看家基因條帶灰度之比的結果見表1。從以上結果可以看出，模型組大鼠股骨CGRP mRNA的表達較假手術組顯著降低(Plt;0.01)。

32組大鼠股骨CGRPR1mRNA的表達

RT-PCR檢測表明，CGRPR1擴增產物為540 bp,見圖3；2組CGRPR1目的基因條帶和G3PDH看家基因條帶灰度之比的結果見表1。從以上結果可以看出，模型組大鼠股骨CGRPR1 mRNA的表達較假手術組顯著降低(Plt;0.01)。

42組大鼠股骨遠端干骺端CGRP的表達

CGRP的陽性標記主要見于骨膜、軟骨細胞、骨細胞、骨髓區細胞和成骨細胞,見圖4；假手術組和模型組免疫陽性部位的平均吸光度見表2。由以上結果可以看出，模型組大鼠股骨遠端干骺端CGRP的表達較假手術組顯著降低(Plt;0.01)。

表1 CGRP和CGRPR1 mRNA的表達

Figure 3.The expression level of CGRPR1 mRNA in femur.1: marker; 2,4,6,8: G3PDH; 3,5: CGRPR1 of sham operation group; 7,9: CGRPR1 of model group.

Figure 4.Immunohistochemistry of CGRP in the metaphysis of distal femur(×200).A: sham operation group; B: model group.

52組大鼠股骨遠端干骺端CGRPR1的表達

CGRPR1的免疫陽性反應見圖5，假手術組和模型組免疫陽性部位的平均吸光度見表2。由以上結果可以看出，模型組大鼠股骨遠端干骺端CGRPR1的表達較假手術組顯著降低(Plt;0.01)。

表2 CGRP 和CGRPR1免疫陽性部位的平均吸光度值

Figure 5.Immunohistochemistry of CGRPR1 in the metaphysis of distal femur(×200).A: sham operation group; B: model group.

討 論

CGRP是一種含有37個氨基酸殘基的活性多肽。它由降鈣素基因編碼而成，在骨組織中主要分布于骨代謝活躍、成骨活性較高的區域，如干骺端、骨膜和髓腔，且骨骺的分布較骨干多。成骨細胞(osteoblast,OB)自身也可自分泌或旁分泌CGRP[10]。

利用CGRP培養液培育SD大鼠頭蓋骨來源的OB，發現外源性CGRP可以促進OB增殖而有利于骨形成[11]。研究還發現CGRP通過增強胰島素樣生長因子I的自分泌作用來間接地調節OB活性，從而發揮成骨效應[12]。此外，CGRP可以明顯刺激體外培養的人成骨細胞樣細胞的cAMP水平，通過cAMP/PKA信號途徑影響OB的代謝[13]。有研究也證實CGRP能夠抑制破骨細胞(osteoclast,OC)的分化及活性[14,15]，通過給去卵巢大鼠外源性注射CGRP可抑制OC的骨吸收作用，但CGRP對OC骨吸收的抑制作用，可能是通過調節OB細胞因子的釋放而間接調節[3]?；趯B活性的促進作用，CGRP能夠促進骨形成[16]。Ballica等[17]用轉基因技術使小鼠OB產生CGRP，發現轉基因鼠的骨密度大幅增高，他們進一步發現，即使切除卵巢后，轉基因鼠的骨密度也只是下降到與正常鼠相同的水平，組織學觀察發現骨密度的增加源于OB數量的增加、成骨速度的加快以及骨吸收的減少。

本實驗發現，大鼠行雙側卵巢切除術12周后能夠形成OP，通過RT-PCR實驗我們發現OP模型大鼠股骨CGRP和CGRPR1 mRNA的表達顯著減少，免疫組織化學染色也表明OP模型大鼠股骨CGRP和CGRPR1蛋白的表達顯著減少。這一結果提示，大鼠骨組織CGRP及CGRPR1水平的降低與OP的形成存在著一定的聯系。CGRP及CGRPR1的減少可能導致其促進骨形成功能的減弱，進一步刺激OP的形成，這可能是OP形成的機制之一。但是，在OP形成過程中，是何種原因導致大鼠股骨CGRP及CGRPR1水平降低及CGRP具體通過哪種途徑來調節骨代謝，還需要進一步的研究。

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ExpressionofCGRPanditstype1receptorinbonetissuesofovariectomizedosteoporoticrats

Lü Chen-peng1,YANG Li1,SUN Ying1,FANG Ji2,FENG Shui-wang1,LIANG Heng2,LI Shu-qin1,ZHANG Rong-hua1

(1DepartmentofChineseMateriaMedica,PharmacyCollege,2DepartmentofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tzrh@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the expression levels of calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its type 1 receptor(CGRPR1) in bone tissues of ovarectomized osteoporotic rats.METHODSFemale SD rats of 3 month old were randomly divided into model group and sham operation group (15 rats in each group).The osteoporotic model was established by bilateral ovariectomy.Twelve weeks after ovariectomy,reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied to detect the mRNA expression of CGRP and CGRPR1 in the femur.The protein expression of CGRP and CGRPR1 in the metaphysis of distal femur was determined by the technique of immunohistochemistry.RESULTSThe mRNA levels of CGRP and CGRPR1 in the femur in model group were significantly lower than those in sham operation group (Plt;0.01).The protein levels of CGRP and CGRPR1 in the metaphysis of distal femur in model group were significantly lower than those in sham operation group (Plt;0.01).CONCLUSIONThe decreased expression of CGRP and CGRPR1 in bone tissues may be one of the mechanisms in the pathogenesis of osteoporotic formation.

Calcitonin gene-related peptide; Osteoporosis; Ovariectomy

1000-4718(2011)05-0976-04

R361.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.027

2010-12-09

2011-03-19

國家自然科學基金資助項目(No.30772885)

△通訊作者 Tel：020-85228578; E-mail: tzrh@jnu.edu.cn