Toll樣受體4/核因子-κB對哮喘大鼠氣道炎癥和重構的影響*

韋江紅, 莫碧文, 黃劍偉

(桂林醫學院附屬醫院呼吸內科，廣西 桂林 541001)

Toll樣受體4/核因子-κB對哮喘大鼠氣道炎癥和重構的影響*

韋江紅, 莫碧文△, 黃劍偉

(桂林醫學院附屬醫院呼吸內科，廣西 桂林 541001)

目的： 探討TLR4/NF-κB對哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重構的影響。方法將18只SD大鼠隨機分成3組:對照組、哮喘4周組和哮喘8周組,每組6只。造模成功后，利用HE染色、免疫組織化學方法及病理圖像分析系統分析大鼠氣道平滑肌的嗜酸性粒細胞(EOS)浸潤情況、氣道壁厚度以及增殖細胞核抗原(PCNA)和Bcl-2的蛋白表達量。利用RT-PCR和Western blotting檢測ASM中TLR4和NF-κB的mRNA及蛋白表達。結果哮喘4周組和哮喘8周組的氣道壁EOS計數、氣道壁厚度、氣道反應性均較正常對照組顯著增加(Plt;0.01)；哮喘4周組和哮喘8周組的TLR4及NF-κB的mRNA水平和蛋白表達與對照組比較均顯著增加(Plt;0.01)；TLR4及NF-κB的mRNA水平隨哮喘天數的增加而顯著增加(Plt;0.01)；哮喘4周組、哮喘8周組PCNA和Bcl-2的蛋白表達量均顯著高于正常對照組(Plt;0.01)；哮喘兩組間上述指標差異顯著(Plt;0.05或Plt;0.01)。結論TLR4/NF-κB可能參與哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重構的調控。

Toll樣受體4； 哮喘； 細胞增殖； 細胞凋亡

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是世界范圍內一種常見多發性慢性氣道炎癥性疾病，迄今它的發病機制仍未完全明確。大量研究顯示，Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是天然免疫和獲得性免疫之間的橋梁[1]，在哮喘的發生發展中可能起著較為重要的作用[2]。核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是一種普遍存在于細胞質中的重要的、多向性的核轉錄因子，其位于TLRs下游信號通路的樞紐位置，參與免疫反應、細胞增殖與分化等過程。

目前國內外對TLR4的研究均局限于體外實驗，即對氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)功能的研究，未見整體動物實驗的研究，因此，我們將建立哮喘動物模型，從整體水平探討TLR4/NF-κB對哮喘氣道炎癥和氣道重構及平滑肌增殖、凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1材料

SPF級SD大鼠(雄性，200-250 g)由廣西醫科大學實驗動物中心提供；戊巴比妥鈉、卵清白蛋白、氫氧化鋁凝膠和多聚甲醛均為Sigma產品；滅活百日咳桿菌為北京生物研究所提供；Taq DNA聚合酶、dNTPs、逆轉錄酶(M-MLV)、隨機引物(random primer)、瓊脂糖和焦碳酸二乙酸均由大連寶生公司提供；PCR特異引物、內參照β肌動蛋白(β-actin)引物及特異性引物均由上海生物工程有限公司合成；地塞米松為揚子藥業產品； PCNAⅠ抗、Bcl-2Ⅰ抗和TLR4Ⅰ抗購自武漢博士德公司；通用蛋白裂解液、吐溫20、考馬斯亮藍和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自碧云天公司；PCR儀為MJ Research Co產品；低溫高速離心機為Beckman產品，紫外分光光度儀為Biochrom產品；GBOX HR型全自動凝膠圖像分析儀為德國產品；Image-Pro Plus 6.0 病理圖像分析軟件為PDA；402AI型超聲霧化器為江蘇省魚躍醫療設備有限公司產品；小動物解剖器械由上海醫療器械(集團)有限公司手術器械廠提供；BG-SUBMINI水平電泳儀和BG-VERMINI垂直電泳儀均為Baygene產品。

2方法

2.1哮喘大鼠模型的建立 第1、8 d將每只大鼠于皮下注射10 mg卵清蛋白(ovalbumin,OVA)和200 mg氫氧化鋁凝膠(混合于1 mL PBS緩沖液)，同時腹腔注射5×109個滅活百日咳桿菌致敏大鼠。于第15 d開始激發：將大鼠置于一密閉容器中，予2％OVA磷酸鹽緩沖液50 mL霧化吸入刺激，每天1次，每次30 min。誘喘成功后大鼠出現煩躁不安，進而呼吸加快、加深，靜伏不動、弓背，嚴重者伸頸、縮胸、收縮呈喘息狀，甚至大小便失禁等。對照組則以磷酸鹽緩沖液代替致敏原注射和霧化吸入。

2.2實驗分組 將18只SD大鼠隨機分成3組，每組6只。A組(對照組)：霧化吸入生理鹽水4周；B組(哮喘4周組)：每天激發哮喘1次，共4周；C組(哮喘8周組)：每天激發哮喘1次，共8周。

2.3氣道反應性的測定 氣管切開插管，接三通管。一管連接動物呼吸機，潮氣量10 mL/kg，頻率60次/min；一管連接呼吸機測壓管道。可直接測氣道壓力，讀數。將鹽酸組胺配成1.28 g/L，然后雙倍稀釋至0.01 g/L。首先將PBS經霧化器噴入氣管插管內，記錄氣管內壓(airway pressure,Paw)，然后將鹽酸組胺的磷酸緩沖液從低濃度開始噴入，1 min開始測壓。若Paw升高不到PBS對照的20％，間隔10 min噴入下一濃度，直到Paw升高20％為止。此時，所需霧吸組胺濃度作為PC20的值。

2.4標本的制備 上述各組大鼠，最后1次激發后24 h內，分別測定氣道阻力，后立即行腹主動脈放血處死，開胸迅速剝離右肺，分離氣道平滑肌(airway smooth muscle，ASM)-80℃凍存，用于RT-PCR測定及Western bloting；左肺氣管內注入4％多聚甲醛約6 mL固定，并置4％多聚甲醛中保存，石蠟包埋備做常規HE染色及免疫組織化學染色。(1) HE染色：經脫蠟、脫水的肺組織石蠟切片，蘇木素染色，70％鹽酸乙醇分化，流水沖洗10 min，1％NaHCO 液中漂洗至藍紫色，伊紅染色5 s，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。(2)氣道壁嗜酸性粒細胞(eosinophils,EOS)計數:石蠟切片作常規HE染色后,選擇結構較完整的支氣管壁，由同一觀察者隨機計數5個高倍視野(×400)下支氣管壁EOS數，取其均數。(3)氣道壁厚度的測定：取各組HE染色左肺3-4級完整支氣管，測量管腔的內周長(perimeter inner,Pi)、管壁面積(wall area,WA)、支氣管平滑肌面積(smooth muscle area,SMA)和支氣管平滑肌細胞核數(the number of bronchial smooth muscle nucleus,N)。將測得的后3個值用Pi進行標準化，分別以WA/ Pi、SMA/ Pi和N/ Pi 表示。

2.5RT-PCR檢測TLR4及NF-κB的mRNA水平 取分離的ASM立即在液氮下研磨，加入RNA提取試劑Trizol(Invitrogen)抽提RNA，嚴格按試劑盒說明書操作。產物mRNA于-80 ℃保存，用于一步法RT-PCR。

① TLR4 RT-PCR擴增反應 TLR4上游引物5’-CGCTTTCACCTCTGCCTTCACTACAG-3’，下游引物5’- ACACTACCACAATAACCTTCGGCTC -3’，擴增產物長度為270 bp。β-actin上游引物5’- GATTACTGCTCTGGCTCCTGC-3’，下游引物5’-GAC-TCATCGTACTCCTGCTTGC-3’，擴增產物長度為150 bp。嚴格按大連寶生生物公司DRR024A一步法RT-PCR反應體系說明書操作。TLR4和β-actin的上、下游引物各1 μL，擴增產物進行瓊脂糖電泳。

② NF-κB PCR擴增反應 NF-κB上游引物5’-GCACGGATGACAGAGGCGTGTATAAGG-3’,下游引物5’- GGCGGATGATCTCCTTCTCTCTGTCTG -3’，擴增產物長度為420 bp。β-actin上游引物5’- GATTACTGCTCTGGCTCCTGC-3’，下游引物5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3’，擴增產物長度為190 bp。嚴格按大連寶生生物公司DRR024A一步法RT-PCR反應體系說明書逐步操作，NF-κB和β-actin的上、下游引物各1 μL，擴增產物進行瓊脂糖電泳。

③ 瓊脂糖電泳 反應成功后，取5 μL PCR產物加1μL DNA上樣緩沖液和PCR marker，點樣在2％瓊脂糖凝膠的樣板孔中，凝膠中含有0.5 mg/L的溴化乙啶(EB)顯色，電泳電壓0.8 V/cm，時間30 min。電泳結束后，采用GBOX HR型全自動圖像分析儀對電泳結果進行分析：分別測定每一個目的基因及看家基因β-actin的吸光度值，取目的基因與β-actin吸光度值的比值。

2.6Western bloting檢測ASM中TLR4蛋白的表達 支氣管平滑肌經機械分散后通用蛋白裂解液提取支氣管平滑肌總蛋白，用Bradford法測定總蛋白濃度，分裝，-80 ℃凍存，待測。聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟如下：取40 μg蛋白質樣品(使用前煮沸變性)上樣后，先以10 V/cm電壓電泳，溴酚藍進入分離膠后，

改電壓為18 V/cm。電泳結束后取出分離膠，安裝半干式電轉移儀，轉膜。取出硝酸纖維素膜，加入封閉液，搖床上室溫孵育1 h。棄封閉液，將膜放入塑料袋中，加入Ⅰ抗稀釋溶液(兔抗鼠TLR4抗體：稀釋度1∶1 000)，搖床上室溫孵育4 h。孵育結束回收Ⅰ抗，用TBST漂洗濾膜3次，10 min/次。然后，加入TBS及Ⅱ抗稀釋溶液(羊抗兔IgG，稀釋度1∶100)，搖床上室溫孵育2 h。取出，TBST中室溫漂洗，共3次，10 min/次。最后加入底物顯色液，待蛋白條帶顏色深度適當，即用PBS緩沖液漂洗，將濾膜用GBOX HR凝膠成像分析系統進行掃描讀取各條帶的吸光度(A)值。

2.7增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及凋亡蛋白Bcl-2的免疫組織化學染色 取石蠟切片后根據SP法染色試劑盒說明步驟進行免疫組織化學染色，Ⅰ抗分別選用小鼠抗大鼠PCNA和Bcl-2單克隆抗體，稀釋度均為1∶200。陰性對照選用PBS緩沖液代替Ⅰ抗，其它步驟相同。

3統計學處理

結 果

1肺組織HE染色及氣道壁EOS浸潤情況

哮喘4周組、哮喘8周組大鼠肺組織HE染色可見細支氣管及血管周圍、肺泡腔、肺泡隔內大量EOS浸潤，細支氣管腔內有過度分泌的黏液；黏膜下層和平滑肌層增厚，管腔變形狹窄；基底膜有大量的膠原沉積。正常對照組無明顯炎癥反應，肺泡腔以及肺間質內未見到EOS，基底膜膠原沉積很少，見圖1。

Figure 1.HE staining of lung tissues in the three groups(×400).A:control group; B: asthmatic 4 weeks group; C: asthmatic 8 weeks group.

哮喘4周組、哮喘8周組的氣道壁EOS計數均較正常對照組顯著增加(均Plt;0.01)，且隨哮喘天數的增加EOS計數也有增加的趨勢，且兩組間比較差異顯著(Plt;0.05)，見表1。

表1 各組大鼠氣道壁EOS浸潤情況及氣道反應性比較

2支氣管壁厚度、支氣管平滑肌厚度及支氣管平滑肌細胞核數量的比較

哮喘4周組及哮喘8周組支氣管壁厚度(WA/Pi)、支氣管壁平滑肌厚度(SMA/Pi)和支氣管壁平滑肌細胞核數量(N/Pi)均較正常對照組顯著增加(Plt;0.01)，且隨哮喘天數的增加上述指標亦有增加趨勢，哮喘8周組較哮喘4周組顯著增加(Plt;0.01)，見表2。

表2 各組大鼠WA/Pi、平滑肌的面積/Pi和N/Pi的比較

3氣道反應性變化

比較各組大鼠氣道反應性結果顯示：哮喘4周組和哮喘8周組的氣道反應性均顯著高于正常對照組(Plt;0.01)，哮喘8周組氣道反應性較哮喘4周組顯著增高(Plt;0.01)，見表1。

4RT-PCR檢測ASM中TLR4及NF-κB的mRNA水平。

各組電泳圖經掃描發現: 哮喘4周組和哮喘8周組的TLR4及NF-κB的mRNA水平顯著高于對照組(Plt;0.01)；TLR4及NF-κB的mRNA水平隨哮喘天數的增加而顯著增加(Plt;0.01)；見表3、圖2、3。

5Westernblotting檢測ASM中TLR4蛋白的表達

各組電泳圖經掃描發現: 哮喘4周組和哮喘8周組ASM的TLR4蛋白表達顯著高于對照組(Plt;0.01)；哮喘8周組的TLR4蛋白表達顯著高于哮喘4周組(Plt;0.01)，TLR4蛋白水平隨哮喘天數的增加而顯著增加，見表3、圖4。

表3 各組大鼠ASM中 TLR4 mRNA 和NF-κB mRNA 以及TLR4蛋白表達比較

Figure 2.RT-PCR amplification of TLR4 mRNA in airway smooth muscle.M: marker; A: asthmatic 8 weeks group; B:asthmatic 4 weeks group; C: control group.

Figure 3.RT-PCR amplification of NF-κB mRNA in airway smooth muscle.M: marker; A:asthmatic 8 weeks group; B: asthmatic 4 weeks group; C: control group.

Figure 4.Western blotting amplification of TLR4 protein in airway smooth muscle.A: asthmatic 8 weeks group; B: asthmatic 4 wees group; C: control.

6ASMCsPCNA及Bcl-2免疫組化染色結果

PCNA以細胞核棕黃色染色為陽性，主要在各組大鼠氣道上皮細胞和ASMCs表達。對照組氣道上皮細胞和ASMCs中PCNA陽性表達數較少，哮喘4周組和哮喘8周組PCNA的蛋白表達量均顯著高于正常對照組(Plt;0.01)，且哮喘兩組間差異顯著(Plt;0.05);Bcl-2以細胞核棕黃色染色為陽性，主要在各組大鼠氣道上皮細胞和ASMCs表達。哮喘4周組和哮喘8周組Bcl-2的蛋白表達與對照組相比顯著增高(Plt;0.01),且哮喘兩組間差異顯著(Plt;0.05)，見表4、圖5、6。

表4 各組大鼠PCNA和Bcl-2蛋白表達量比較

Figure 5.The expression of PCNA protein in airway smooth muscle in the three groups(immunohistochemical staining,×400).A:control group; B: asthmatic 4 weeks group; C: asthmatic 8 weeks group.

Figure 6.The expression of Bcl-2 protein in airway smooth muscle in the three groups(immunohistochemical staining，×400).A: control group ；B: asthmatic 4 weeks group；C :asthmatic 8 weeks group.

討 論

哮喘是由多種細胞(如嗜酸粒細胞、肥大細胞、T細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾患[3-5]。哮喘的特征性病理改變表現為氣道炎癥和氣道重構。氣道炎癥是以嗜酸性粒細胞浸潤為主的過敏反應性炎癥，其可加重氣道高反應性[6]。TLRs是重要的細胞膜受體，HASMCs表達TLR1-TLR10 mRNA。TLR4被激活后可以將胞外信號傳入胞內從而激活下游信號分子介導炎癥反應[7]。NF-κB位于TLRs下游信號通路的樞紐位置參與細胞的炎癥反應。TLRs對哮喘的作用越來越受到重視，成為揭示哮喘發病機制的一個新的可能途徑。

通過HE染色結果顯示：發現OVA抗原致敏激發能使SD大鼠EOS數量、氣道反應性顯著高于對照組；且隨哮喘天數的增加而明顯增加。此外，經標化后的氣道壁和平滑肌層厚度的測量數值可以消除不同個體及不同部位來源的支氣管比較時所造成的差別，是判斷氣道重構的客觀指標。而我們實驗結果顯示：哮喘4周組及哮喘8周組支氣管壁厚度(WA/Pi)、支氣管壁平滑肌厚度(SMA/Pi)、支氣管壁平滑肌細胞核數量(N/Pi)均較正常對照組顯著增加，且隨哮喘天數的增加上述指標亦有增加趨勢，提示哮喘SD大鼠模型復制成功，哮喘時氣道存在炎癥細胞的浸潤、ASM組織發生增厚同時伴發氣道高反應性。

通過免疫組織化學、RT-PCR、Western bloting分子生物學技術研究同時發現，哮喘4周組及哮喘8周組大鼠ASM中TLR4的陽性表達、TLR4 mRNA和TLR4蛋白的表達水平要顯著高于對照組，且隨哮喘天數的增加而顯著增加。EOS計數、氣道反應性改變與相應各組大鼠ASM中TLR4的陽性表達、TLR4 mRNA和TLR4蛋白的表達水平一致，因此我們推測，OVA作為抗原刺激能促進哮喘大鼠ASM中TLR4的表達，參與哮喘的氣道炎癥，并在其發生發展中起重要作用。而哮喘4周組及哮喘8周組NF-κB mRNA和蛋白的表達水平與對照組比較，顯著增高，提示TLR4表達的增加可能誘導NF-κB的活化，說明NF-κB作為TLR4的下游信號分子存在。其機制可能是TLRs結合配體后，通過TIR域(Toll/ IL-1R域)招募MyD 88(Myeloid differentiation factor 88),MyD88再通過氨基端死亡區域的嗜同種反應募集下游IRAK家族成員，進而激活轉錄因子NF-κB和/或AP-1，引發促炎細胞因子基因的轉錄和表達，釋放細胞因子，產生不同的生物學效應:調節炎性細胞因子分泌、細胞增殖、分化、凋亡等基因的轉錄[8]。國內學者證實NF-κB參與哮喘大鼠 ASMCs增殖,抑制 NF- κ B 活性能降低哮喘大鼠ASMCs增殖[9]。氣道重構是頑固性哮喘的重要病理生理基礎[10]，而哮喘時ASMCs增殖是氣道重構的重要原因，但其發病機制尚未完全明確[11]。哮喘大鼠發生氣道重構，與各組大鼠ASM中TLR4、NF-κB的mRNA和TLR4蛋白的表達水平一致，我們推測TLR4/NF-κB可能通過促進ASMCs增生、增厚，參與哮喘氣道重構過程。

ASMCs的增殖增加和凋亡抑制是氣道壁增厚、氣道重構的重要病理基礎。PCNA是一種與細胞增殖有關的參與DNA合成的核蛋白，是僅能在增殖細胞中合成和表達的36 kD核內多肽鏈。PCNA的表達與細胞增殖狀態、分化活躍程度有關，是一個被廣泛應用于檢測細胞增殖功能的敏感指標。Bcl-2是重要的抑制凋亡蛋白。因此，我們選用其PCNA和 Bcl-2作為ASMCs增殖和凋亡的檢測指標。實驗結果顯示：哮喘4周組和哮喘8周組PCNA的蛋白表達量均顯著高于對照組，且隨哮喘天數的增加而增高，表明哮喘ASM增殖與PCNA的表達水平增加有關。哮喘4周組和哮喘8周組Bcl-2的表達量與對照組相比也顯著增高，且隨哮喘天數的增加而增高，提示哮喘大鼠ASM存在凋亡不足。這一結果與TLR4和NF-κB在各組ASM中的表達情況相一致，我們推測ASM的PCNA和Bcl-2的蛋白表達量受TLR4和NF-κB的調控。根據以上實驗結果我們推測TLR4/NF-κB參與ASMCs的增殖、凋亡，在哮喘的氣道重構中起重要作用。

綜上所述，我們的研究結果初步顯示TLR4/NF-κB可能參與哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重構；TLR4/NF-κB可能參與哮喘大鼠ASMCs增殖、凋亡的調控。

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EffectofTLR4/NF-κBonairwayinflammationandairwayremodelinginratmodelofasthma

WEI Jiang-hong,MO Bi-wen,HUANG Jian-wei

(DepartmentofRespiratoryMedicine,HospitalAffiliatedtoGuilinMedicalCollege,Guilin541001,China.E-mail:Mobiwen2002@sohu.com)

AIM: To explore the effect of TLR4/NF-κB on airway inflammation and airway remodeling in a rat asthma model.METHODSEighteen SD rats were divided into 3 groups (n=6): control group,asthmatic 4 weeks group and asthmatic 8 weeks group.The methods of HE staining,immunohistochemistry and pathology image analysis were used to detect the changes of eosinophile granulocytes (EOS),the thickness of airway wall and the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) and Bcl-2 in the airway smooth muscle in asthmatic rats.The expression of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein levels in the airway smooth muscle was determined by RT-PCR and Western blotting.RESULTSThe EOS,the thickness of airway wall and airway reactivity in asthmatic group were significantly higher than those in control group.The expression of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein levels in asthmatic group was significantly higher than those in control group.The protein levels of PCNA and Bcl-2 were significantly higher than those in control group.Significant difference between two asthmatic groups was observed in the above indexes.CONCLUSIONTLR4 /NF-κB may regulate the airway inflammation and airway remodeling in asthmatic rats.

Toll-like receptor 4; Asthma; Cell proliferation; Apoptosis

1000-4718(2011)05-0962-06

R562.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.024

2010-10-14

2011-03-07

國家自然科學基金資助項目(No.30760083)；廣西科學研究與技術開發計劃資助項目(No.桂科攻0719006-2-8)；廣西衛生廳基金資助項目(No.重200732;No.重200976)；桂林市科學研究與技術開發計劃資助項目(No.20080320-1)；廣西青年科學基金資助項目(No.桂科青0991085)；桂林醫學院2009年碩士研究生科研創新資助項目(No.555);廣西醫療衛生自籌基金資助項目(No .Z2008266)

△通訊作者 Tel：0773-2823748;E-mail：Mobiwen2002@sohu.com