RIP2對大腸桿菌的抗菌作用研究*

席 瓊， 胡巢鳳， 張 蕓， 陸大祥， 蔣 宇

(暨南大學醫學院病理生理學教研室，國家中醫藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

RIP2對大腸桿菌的抗菌作用研究*

席 瓊， 胡巢鳳△， 張 蕓， 陸大祥， 蔣 宇

(暨南大學醫學院病理生理學教研室，國家中醫藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

目的： 探討受體相互作用蛋白2(RIP2)對人腸細胞清除大腸桿菌的作用。方法使用陽離子聚合物JetPeiTM介導人RIP2基因(pEGFP-C2-PIP2)轉染人結腸癌SW480細胞株，以轉染空質粒及未轉染的SW480細胞株作為對照，應用RT-PCR檢測外源性RIP2 mRNA水平的變化、Western blotting法檢測細胞RIP2蛋白的表達；并利用大腸桿菌ATCC25922感染轉染和未轉染的SW480細胞24 h,用平板培養菌落計數活菌數。應用p38 MAPK通路抑制劑SB203580作用于3組細胞，計數活菌數。結果與對照組相比，轉染RIP2組其mRNA和蛋白表達水平均有明顯升高(Plt;0.01,Plt;0.05)，表明RIP2表達質粒成功轉染SW480細胞。轉染RIP2細胞能清除胞內大腸桿菌；而阻斷p38 MAPK信號通路后，RIP2清除胞內大腸桿菌的作用被阻斷。結論RIP2轉染細胞可有效清除胞內大腸桿菌，這種胞內細菌的清除作用可能與p38 MAPK信號通路有關。這些結果提示RIP2在細菌感染性疾病治療中具有廣闊的臨床應用前景。

受體相互作用蛋白2； 基因轉染； 抗菌作用

受體相互作用蛋白2(receptor-interacing protein 2,RIP2)，也稱為RIPK2、RICK或CARDIAK，是RIP激酶家族的成員，其基因全長1 623 bp，表達61 kD蛋白，在多種組織中均有分布。RIP2的 N-末端包含有信號轉導途徑中關鍵的絲/蘇氨酸激酶結構域， C-末端含caspase募集結構域(caspase recruitment domain,CARD)，可與多種蛋白相互作用，發揮其生理功能。RIP2參與固有免疫和獲得性免疫中多個受體的信號轉導[1]，被認為是固有免疫和特異性免疫信號途徑的重要銜接分子，在免疫及炎癥反應中起重要作用。

固有免疫系統通過免疫識別模式受體(pattern-recognition receptors,PRRs)識別入侵的病原體，其主要包括Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)家族和NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs )家族，而RIP2是NLRs的下游因子，激活后能啟動下游分子級聯反應，銜接NLRs并激活NF-κB (nuclear factor-κB)信號轉導通路[2]，引起宿主的天然和獲得性免疫反應，在先天性免疫反應和清除病原感染的炎癥反應中起著重要作用。對RIP2的研究可以加深我們對細胞內外模式識別受體參與免疫應答和炎癥防御機制的認識。本實驗選擇大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli) 為入侵病原體，利用轉染RIP2基因觀察其表達情況，同時將轉染細胞與大腸桿菌共同孵育，觀察RIP2對大腸桿菌的作用，并初步探討其作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

質粒pEGFP-C2為本室保存；pEGFP-C2-RIP2真核表達質粒由本課題組構建，經酶切及測序鑒定后保存在本實驗室。大腸桿菌ATCC25922由暨南大學附屬華僑醫院檢驗科惠贈。人結腸癌細胞系SW480由暨南大學病理教研室惠贈。細胞轉染所用的陽離子聚合物JetPEITM為Polyplus產品；細胞培養基DMEM為Gibco產品；胎牛血清購自Hyclone；細胞培養板為Corning Costar產品；Trizol、MMLV reverse transcriptase試劑盒購自Invitrogen；PCR試劑盒購自TaKaRa；BCA蛋白質定量測定試劑盒為上海申能博彩生物公司產品；兔抗人RIP2多抗購自Santa Cruz，羊抗兔IgG抗體購自博士德生物公司；Triton X-100購自Sigma；p38 MAPK抑制劑SB203580購自Promega。其余試劑為國產分析純。

2細胞培養及重組質粒轉染細胞

SW480細胞采用DMEM高糖培養液，加入10％的胎牛血清及0.1 g/L青霉素和鏈霉素，在37 ℃、5％的CO2條件下進行細胞培養及傳代。SW480細胞按5×108cells/L分別接種于6孔板內，待細胞生長至80％融合時進行轉染。將2 μg質粒DNA稀釋于150 μL濃度為0.15 mol/L的NaCl中(DNA溶液)；4 μL JetPEITM稀釋于150 μL濃度為0.15 mol/L NaCl中(JetPEITM溶液)，充分混勻后將JetPEITM溶液加入DNA溶液中，將該JetPEITM/DNA復合物在室溫下孵育20 min后加入培養SW480細胞的6孔板，輕搖混勻,置于37 ℃、5％CO2培養箱中孵育。48 h后將轉染的SW480細胞置于Olympus BX-51倒置熒光顯微鏡下，用488 nm波長紫外光激發,發射光波長為507 nm觀察細胞中綠色熒光的表達。

3RT-PCR法檢測RIP2的mRNA表達

實驗分組：(1) pEGFP-C2-RIP2轉染組；(2) pEGFP-C2轉染組；(3)未轉染組。按Trizol試劑盒說明書抽提細胞總RNA，以1 μg RNA為模板，按照MMLV逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA；根據GenBank資料設計RIP2引物如下：上游5’-TCCCTACCACAAACTCGCC-3’；下游5’- GCATCCTTTCTTTCACTGTCG-3’(擴增產物150 bp)；以GAPDH(上游5’- CCAATATGATACCACCCATG-3’,下游5’- AGGTCCACCACTGACACGTT-3’，擴增產物為594 bp)為內參照進行PCR反應。RT-PCR反應條件:98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。取5 μL用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上成像及灰度分析，分析目的條帶與相應的GAPDH條帶灰度比值。

4Western蛋白印跡檢測RIP2蛋白表達

實驗分組如前。收集轉染或未轉染的SW480細胞5×106cells,培養細胞用冰冷PBS洗3次后，加入PMSF裂解緩沖液。冰浴30 min后將裂解物以12 000×g離心5 min，收集上清。Bradford法檢測蛋白質的含量。在SDS-PAGE(5％濃縮膠，10％分離膠)上進行分離后，電轉移至硝酸纖維(PVDF)薄膜上。5％ 脫脂牛奶封閉2 h后，將PVDF膜與兔抗人RIP2多抗4 ℃過夜孵育。洗膜3次后與生物素標記的抗兔IgG抗體室溫孵育1 h。最后用ECL試劑檢測結果,并曝光于X光片上。Bio-Rad圖像分析儀分析目的蛋白條帶與相應的GAPDH條帶相對灰度比值。

5細菌培養及計數

挑取ATCC25922單菌落，在LB液體培養基中37 ℃、150 r/min振搖培養4 h，取100 μL菌液至LB固體培養板，37 ℃孵箱培養過夜，24 h后收集細菌至離心管，10 000 r/min離心5 min收集細菌沉淀，將細菌重懸于無菌生理鹽水，利用分光光度計測定菌液A值(600 nm)，用平板記數法檢測最終培養濃度。再以已知菌濃度的菌液A值為橫坐標，以細菌濃度為縱坐標，建立細菌數與A值關系曲線，獲得直線回歸方程[3]，從而確定細菌感染濃度。

6大腸桿菌胞內活菌數量的測定

大腸桿菌按上法定量至4×1010CFU/L。按常規培養SW480細胞，將濃度調至4×108cells/L,每孔加0.1 mL于48孔培養板,待細胞貼壁生長至80％，棄去培養孔中的液體，每孔加入0.1 mL菌液，37 ℃共同作用2 h后棄去菌液并用PBS洗3次以去除未黏附的細菌。再將每孔加入含有10％胎牛血清、100 mg/L慶大霉素的DMEM培養基300 μL(慶大霉素不進入細胞內，只殺死胞外細菌)，置于37 ℃、5％ CO2培養箱中孵育以殺死細胞外細菌。分別于實驗4、24和36h后每孔加入Triton X-100裂解細胞15 min,漩渦振蕩后將裂解液作10倍系列稀釋，每個稀釋度取100 μL涂布LB平板(每個稀釋度取涂2塊板)，置于37 ℃溫箱中培養24 h。觀察菌落形成單位(CFU)數量,計算出每孔細胞內的活菌數量。

7各組細胞對大腸桿菌胞內清除作用的檢測

實驗分3組：(1) pEGFP-C2-RIP2轉染細胞+細菌；(2) pEGFP-C2轉染細胞+細菌；(3)未轉染細胞+細菌。將以上分組細胞以4×104cells接種于48孔板，實驗方法如前所述，在細菌感染細胞后的24 h用Triton X-100裂解細胞15 min，漩渦振蕩后將裂解液作10倍系列稀釋，每個稀釋度取100μL涂布LB平板(每個稀釋度取涂2塊板)，置于37℃溫箱中培養，24 h后計數胞內活菌數。

8SB203580對各組細胞感染大腸桿菌的影響

實驗分6組：(1)pEGFP-C2-RIP2轉染細胞+細菌+SB203580；(2)pEGFP-C2-RIP2轉染細胞+細菌；(3)pEGFP-C2轉染細胞+細菌+SB203580；(4)pEGFP-C2轉染細胞+細菌；(5)未轉染細胞+細菌+SB203580;(6)未轉染細胞+細菌。細菌感染前用10 μmol/L的SB203580刺激細胞2 h，之后加入細菌共孵育，方法如前述。24 h后計數胞內活菌數。

9統計學處理

結 果

1RIP2mRNA在人結腸癌細胞株SW480中的表達

pEGFP-C2-RIP2和pEGFP-C2轉染細胞48 h后，多數細胞胞漿區可觀察到綠色熒光蛋白的表達，未轉染組無綠色熒光蛋白表達。RIP2 mRNA片段為150 bp,內參照GAPDH片段為594 bp,見圖1，擴增產物與預計一致。pEGFP-C2-RIP2轉染細胞組RIP2 mRNA的含量較pEGFP-C2轉染細胞組和未轉染細胞組明顯增高，組間比較差異顯著(Plt;0.01)。而pEGFP-C2轉染細胞組和未轉染細胞組之間RIP2 mRNA表達無顯著差異(Pgt;0.05),見圖1。

2RIP2蛋白在SW480細胞中的表達

Western blotting結果顯示，在61 kD處有明顯的特異性蛋白條帶,與RIP2蛋白的分子量相符。pEGFP-C2-RIP2轉染細胞組RIP2 蛋白表達較pEGFP-C2轉染細胞組和未轉染細胞組明顯增高(Plt;0.05)。而pEGFP-C2轉染細胞組和未轉染細胞組之間RIP2 蛋白表達無顯著差異(Pgt;0.05),見圖2。

Figure 1.RIP2 mRNA expression in SW480 cells detected by RT-PCR.Marker：2 000 bp DNA marker；1: SW480 cells transfected with pEGFP- C2-RIP2；2: SW480 cells transfected with pEGFP- C2；3: SW480 cells without transfection.±s.n=3.**Plt;0.01 vs 2 and 3.

Figure 2.RIP2 protein expression in SW480 cells detected by Western blotting.1: SW480 cells transfected with pEGFP- C2-RIP2；2: SW480 cells transfected with pEGFP- C2；3: SW480 cells without transfection±s.n=3.*Plt;0.05 vs 2 and 3.

3大腸桿菌細菌數與A值的關系

以已知菌濃度的菌液A值為橫坐標，以細菌濃度為縱坐標，建立細菌數與A值關系曲線,得到該菌的回歸方程：細菌數Y=14.362X-0.052,見圖3。用此方程可計算細菌感染濃度。本研究選擇細菌感染濃度為4×1010CFU/L，每孔加入0.1 mL菌液。

Figure 3.The relationship curve between A value and bacterial number of E.coli.

4大腸桿菌胞內生長曲線

實驗結果表明,隨感染時間延長(4 h、24 h、36 h),SW480細胞內大腸桿菌數量不斷增加，見圖4。本研究選擇大腸桿菌在細胞內感染時間為24 h。

Figure 4.The growth curve of E.coli in SW480 cells.

5轉染RIP2后細胞對大腸桿菌的清除作用

pEGFP- C2-RIP2組胞內細菌數量為(1.14×1010±1.1×108)CFU/L，明顯低于pEGFP- C2 轉染組(1.63×1010±0.44×108)CFU/L和未轉染組(1.62×1010±0.33×108)CFU/L(Plt;0.01),提示RIP2轉染細胞可以清除胞內大腸桿菌,見圖5。

6SB203580對RIP2抗菌作用的影響

pEGFP- C2-RIP2組細菌數量明顯低于pEGFP- C2 轉染組(Plt;0.01)，而加入SB203580后pEGFP- C2-RIP2組細胞內細菌數明顯增加，與pEGFP- C2 轉染組和未轉染組比較無顯著差別(Pgt;0.05)，提示p38 MAPK 抑制劑SB203580能阻斷RIP2清除胞內大腸桿菌的作用，見圖6。

Figure 5.Comparison of the intracellular viable count of E.coli in SW480 cells.1: SW480 cells transfected with pEGFP- C2-RIP2；2: SW480 cells transfected with pEGFP- C2；3: SW480 cells without transfection±s.n=6.**Plt;0.01 vs 2 and 3.

Figure 6.Effect of SB203580 on the intracellular viable count of E.coli in SW480 cells.1: SW480 cells transfected with pEGFP- C2-RIP2；2: SW480 cells transfected with pEGFP- C2；3: SW480 cells without transfection±s.n=6.**Plt;0.01 vs other groups.

討 論

大腸桿菌是致病性革蘭氏陰性腸道菌，其胞壁上的肽聚糖在感染時可被宿主NLRs識別，通過RIP2信號分子激活細胞核內核轉錄因子NF-κB轉錄，表達炎性細胞因子，引發宿主的固有免疫應答[4]。在黏膜表面上皮細胞(如結腸上皮細胞)，由于細胞不斷與菌叢接觸，TLRs表達下調，以避免PAMPs對細胞的刺激導致這些組織的異常炎癥反應。當這些細胞感染了病原體，PAMPs可轉入細胞內，與NOD蛋白相互作用，啟動防御反應[5]，NOD 的寡聚化誘導了 RIP2 蛋白并導致 NF-κB 的活化，因此，RIP2在抵御病原體入侵過程中發揮了重要作用。RIP2基因位于8q21,編碼RIP2蛋白，在脾臟、外周血白細胞、胎盤等組織中呈現高表達。研究發現，RIP2缺陷型巨噬細胞游走延遲，細胞內感染增加，臨床病程遷移；相反早期RIP2表達上調往往臨床預后較好[6]。

近年來發現，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路參與細胞的生長發育及細胞間功能同步等多種生理過程，它通過磷酸化下游激酶和轉錄因子而參與各種信號轉導[7]。目前在哺乳動物中已發現和成功克隆了細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinases,ERKs)、應激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinases,SAPK,又稱JNK)和p38 MAPK 3個MAPK亞族。其中p38 MAPK主要參與炎癥反應、應激反應，還參與細胞增殖、凋亡和分化[8]。各種細胞外信號包括細菌、活性氧、細胞因子、紫外線照射、高滲狀態等均能激活p38 MAPK。p38激活后可趨化和活化白細胞、激活單核-巨噬細胞系統，在人體屏障功能中起重要作用。p38 MAPK特異性抑制劑SB203580(吡啶異噠唑衍生物)競爭性結合p38 MAPK的ATP位點，可阻止p38 MAPK激活下游底物[9]，從而阻斷p38 MAPK的信號轉導通路，并可減少或阻斷多種炎癥介質。SB203580活性的IC50大約為0.5 μmol/L[10]，并存在劑量依賴(0.1-10 μmol/L)，最強的抑制作用發生在10 μmol/L時[11]。

腸道感染是臨床實踐中最常見的細菌感染之一，宿主多種防御機制和抗生素治療可有效殺滅腸道細菌，本研究發現，將構建的RIP2基因轉染至腸道細胞后，RT-PCR和Western blotting檢測分別證實了其mRNA轉錄水平和蛋白表達水平明顯增加；在大腸桿菌感染腸道細胞后，隨著時間的增長，其胞內菌也隨之增長。而將大腸桿菌感染轉染RIP2的細胞，發現細胞胞內菌數量明顯減少，與未轉染組和空質粒轉染組相比具有顯著差異，說明RIP2對大腸桿菌有明顯的抑制作用；而加入p38 MAPK通路抑制劑SB203580，則其清除胞內大腸桿菌的作用被阻斷，說明RIP2的抗菌作用可能與p38 MAPK信號通路有關。隨著對NLRs信號轉導機制的深入研究，RIP2可作為腸道細菌感染治療的新靶點，將有助于預防和治療感染性疾病。

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ExpressionofRIP2enhancesclearanceofintracellularEscherichiacoliinSW480cells

XI Qiong,HU Chao-feng,ZHANG Yun,LU Da-xiang,JIANG Yu

(DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thcf@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the clearance effect and mechanism of high expression of receptor-interacting protein 2 (RIP2) againstEscherichiacoli(E.coli) in intestinal cells.METHODSRIP2 gene (pEGFP-C2-PIP2) was transfected into cell line SW480 by the method of JetPeiTM.Western blotting and RT-PCR analysis were then used to detect RIP2 protein and mRNA expression,respectively.The transfected and non-transfected cells were incubated withE.coliat 37 ℃.At 24 h after initial incubation,the viable intracellular bacteria were quantified by plating appropriate dilution on LB agar plates.The transfected and non-transfected cells were treated with SB203580,an inhibitor of p38 MAPK pathway,and the changes of intracellular bacteria were also quantified.RESULTSCompared with the cells transfected with pEGFP-C2 and non-transfected cells,the expression of RIP2 at mRNA and protein levels was significantly enhanced in SW480 cells transfected with recombinant plasmid pEGFP-C2-PIP2 (Plt;0.01 andPlt;0.05,respectively).The cells transfected with pEGFP-C2-PIP2 had the ability to clear invadingE.coli,and this antibacterial effect was inhibited by a p38 MAPK inhibitor SB203580.CONCLUSIONRIP2 effectively eliminates the invadingE.coli,and p38 MAPK pathway plays an important role in the clearance effect of RIP2,indicating that RIP2 may be a potential molecular therapeutic target for infectious disease.

Receptor-interacting protein 2; Gene transfection; Antibacterial effect

1000-4718(2011)05-0951-05

R392.11

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.022

2011-01-06

2011-03-04

廣東省自然科學基金資助項目(No.06025159)；廣東省教育廳自然科學研究項目[No.粵財教(2005)126]；暨南大學“211工程”三期預研項目；暨南大學重點實驗室基金資助項目

△通訊作者 Tel: 020-85228079；E -mail：thcf@jnu.edu.cn