pIRES2-EGFP-BCL11B真核表達載體體外表達的動態分析*

陳 思， 黃 欣， 楊力建， 陳少華， 鄭海濤， 沈 琦， 李 萡， 李揚秋,3△

(暨南大學1醫學院血液病研究所，3教育部再生醫學重點實驗室，廣東 廣州 510632；2深圳大學醫學院免疫學教研室，廣東 深圳 518060)

pIRES2-EGFP-BCL11B真核表達載體體外表達的動態分析*

陳 思1,2， 黃 欣1， 楊力建1， 陳少華1， 鄭海濤1， 沈 琦1， 李 萡1， 李揚秋1,3△

(暨南大學1醫學院血液病研究所，3教育部再生醫學重點實驗室，廣東 廣州 510632；2深圳大學醫學院免疫學教研室，廣東 深圳 518060)

目的： 研究真核表達載體pIRES2-EGFP-BCL11B(B細胞白血病/淋巴瘤11B基因)在K293(人胚腎細胞株)和Raji(人Burkitt 淋巴瘤細胞株)細胞中的表達情況。方法分別利用脂質體和核轉染技術將真核表達載體pIRES2-EGFP-BCL11B(pBCL11B)轉染至K293和Raji細胞中，并設立空質粒組(pI2)和空轉染組(MOCK)作為對照。通過熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測轉染后48 h各組EGFP的表達，確定轉染效率。通過熒光實時定量PCR(Taqman)技術檢測轉染后24 h各組BCL11B mRNA的表達情況，通過Western blotting技術檢測轉染后48 h各組BCL11B蛋白的表達情況。高分辨率活細胞成像系統動態觀察轉染后36-72 h重組質粒在Raji細胞增殖過程中的表達。結果K293細胞pBCL11B、pI2和MOCK組的轉染效率分別為(71.23±4.62)％、(70.45±3.58)％和(0.30±0.10)％，而Raji細胞各組的轉染效率分別為(23.12±5.94)％、(22.48±6.25)％和(0.30±0.10)％。實時定量PCR和Western blotting結果顯示轉染后pBCL11B組在mRNA和蛋白水平均能檢測到BCL11B基因的有效表達，BCL11B的表達量均明顯高于pI2組和MOCK組(Plt;0.05)。活細胞追蹤顯示轉染后36-72 h重組質粒在細胞中可穩定表達且轉染后的細胞可以正常分裂增殖。結論系統分析了真核表達載體pIRES2-EGFP-BCL11B轉染至K293和Raji細胞的表達變化特點，轉染后可以檢測到該基因的有效上調，研究結果為下一步轉染正常人T細胞奠定了基礎。

基因,BCL11B； 真核表達載體； K293細胞； Raji細胞

B細胞淋巴瘤/白血病11B(B-cell lymphoma/leukemia 11B,BCL11B)基因是近年來發現的Bcl家族的新成員，在T細胞發育、分化和增殖中發揮重要的調節作用。動物實驗已證實，BCL11B基因是小鼠胸腺細胞發育、分化和存活所必須的基因，BCL11B的缺失會導致胸腺雙陽性細胞的陽性選擇受阻、T細胞受體(T-cell receptor,TCR)α、β發育受阻及胸腺細胞凋亡增加[1,2]。同時，體外實驗證實該基因與維持腫瘤性T細胞株(Juakat和huT-78)的生存密切相關[3]。但是，BCL11B基因對于人類T細胞的作用仍少見報道，其功能、靶基因及作用機制也尚未完全清楚。本研究將成功構建的pIRES2-EGFP-BCL11B真核表達載體分別轉染至幾乎不表達BCL11B基因的K293和Raji細胞中[BCL11B基因mRNA水平基礎表達量分別為(6.7±0.5)/105個β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2M)拷貝和(1.8±0.2)/105個β2M拷貝，分析其在真核細胞中表達的動態變化情況，從而為進一步轉染該基因至正常人T細胞、明確該基因對正常人T細胞的影響提供基礎研究。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑和儀器 核轉染儀及試劑盒(Amaxa)；Chromo 4實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；流式細胞儀(Beckman-Coulter)；Delta Vision 高分辨率顯微鏡系統(Applied Precision)；電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)；超凈工作臺(廣興醫學生物工程研究所)；電泳儀及轉印系統(Bio-Rad)；Trizol 試劑盒、反轉錄酶試劑盒和脂質體LipofectamineTM2000(Invitrogen)；RPMI-1640 培養液(Gibco)；小牛血清(四季青)；熒光實時定量 PCR的Ampli Taq Gold 試劑盒(Roche)；引物(TIB Molbiol)；RIPA蛋白提取試劑盒(申能博彩)；小鼠抗人β-actin單抗(博士德)；兔抗人BCL11B單抗(Bethyl)；兔抗人EGFP單抗、羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG單抗(eBioscience)；DAB顯影試劑盒(Tiangen)；標準品由合作伙伴德國Greifswald大學血液腫瘤專科Schmidt教授惠贈。

1.2K293和Raji細胞 為本所保存。

1.3重組質粒pIRES2-EGFP-BCL11B 為合作伙伴德國Greifswald大學Schmidt教授惠贈。

2方法

2.1實驗分組 轉染貼壁細胞K293和懸浮細胞Raji均分為3組，分別為轉染重組質粒組(pBCL11B)、空質粒組(pI2)和空轉染組(MOCK)。

2.2K293和Raji細胞培養 K293細胞用含10％ 小牛血清、1×105U/L青-鏈霉素的IMDM培養基，于37 ℃、5％ CO2飽和濕度培養箱內培養，貼壁細胞達80％瓶壁面積時以0.25％胰酶消化、傳代。Raji細胞用含10％ 小牛血清、1×105U/L青-鏈霉素的RPMI-1640培養基，于37 ℃、5％ CO2飽和濕度培養箱內培養。

2.3重組質粒的酶切鑒定 將重組質粒分別用XhoⅠ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定，反應體系為為20 μL，包括pIRES2-BCL11B-EGFP重組質粒5 μL、10×buffer Tango 4 μL、XhoⅠ和BamHⅠ內切酶各1 μL、超純水9 μL，混勻后置于37 ℃作用4 h。酶切產物用1％ 的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.4脂質體介導重組質粒轉染K293細胞株 轉染前24 h將K293細胞傳代、接種于25 cm2的培養瓶中。用無抗生素無血清的IMDM 培養基分別稀釋5 μg 的pIRES2-BCL11B- EGFP重組質粒和15 μL脂質體 LipofectamineTM2000至終體積為300 μL，培養6 h后去上清，更換為完全培養基繼續培養。

2.5核轉染介導重組質粒轉染Raji細胞株 收集2.5×106處于對數生長期的Raji細胞，200×g離心10 min，完全去除上清。用100 μL 預熱至室溫的NucleofectorTMSolution和Supplement混合液懸浮細胞，加入5 μg BCL11B重組質粒，用核轉染專用的移液管混勻后加入核轉杯，啟動核酸轉染儀細胞特異性程序(M-013)，程序完成后立刻用專用的移液管將轉染后的細胞液，接種于RPMI-1640培養基的培養瓶中，培養6-12 h后離心去上清，更換培養基繼續培養。

2.6轉染效率檢測 收集轉染后48 h的細胞約1×105，一方面熒光顯微鏡激發光下觀察轉染細胞增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent proteins,EGFP)表達情況；另一方面，離心后用0.5 mL 1×PBS洗2次，重懸吹勻后用200 μL 1×PBS重懸細胞，在488 nm的激發光下，用于流式細胞儀分析EGFP表達情況。

2.7實時定量PCR檢測BCL11B mRNA的表達 分別收集轉染后24 h各組細胞，常規方法提取RNA，合成cDNA。熒光實時定量PCR總反應體積為25 μL，包括dATP、dCTP和dGTP各0.1 mmol/L，dUTP 0.2 mmol/L，0.75 U Ampli Taq Gold 聚合酶，0.25 U 尿嘧啶糖基酶(UNG)，1×PCR緩沖液，4.5 mmol/L MgCl2以及0.5 μmol/L上、下游引物，0.1 μmol/L 6FAM-TAMRA探針和2 μL cDNA或標準品。應用于熒光實時定量PCR的引物和探針具體序列見表1。在50℃ 2 min，95℃ 5 min變性后，共進行45循環擴增，每一循環包括95℃ 15 s和64℃ 1 min。根據樣本中的β2M拷貝數，計算100 000個β2M拷貝中所含BCL11B拷貝數。計算公式為：n=100 000× BCL11B/β2M。

表1 用于實時定量PCR(TaqMan)的引物和探針序列

2.8Western blotting檢測BCL11B蛋白的表達 分別收集轉染后48h各組約1.5×106細胞，用RIPA蛋白裂解液試劑盒提取總蛋白。將各組蛋白樣品按常規方法定量，并變性后加樣于10％ 的SDS-PAGE膠中，恒壓60 V 30 min后改為80 V 45 min。用半干轉儀進行轉膜，恒壓15 V 15 min。用3％ blocking reagent封閉NC膜1 h。根據所需要的蛋白分子量大小(β-actin蛋白42 kD，EGFP蛋白48 kD，BCL11B蛋白120 kD)和預染marker的指示位置，將NC膜剪成小條帶，分別放入1∶500的小鼠抗人β-actinⅠ抗、1∶500的兔抗人EGFP單抗、1∶5 000的兔抗人BCL11BⅠ抗，4 ℃過夜。再分別放入1∶300的羊抗小鼠和羊抗兔Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h。通過DAB試劑盒檢測人內參照基因β-actin蛋白、標記基因EGFP蛋白以及目的蛋白BCL11B的表達情況。掃描圖像，最后通過Image Quantition灰度分析軟件分析各組條帶的灰度值，以各組β-actin的灰度值為內參照，計算各組EGFP和BCL11B蛋白水平的表達情況。

2.9BCL11B基因在Raji細胞的動態檢測 在轉染后36-72 h利用高分辨率活細胞成像系統動態監測轉染重組質粒的Raji細胞中EGFP變化情況。

3統計學處理

結 果

1pIRES2-BCL11B-EGFP重組質粒的PCR擴增和雙酶切鑒定

應用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切pIRES2-BCL11B-EGFP真核表達質粒，得到大小為2 479 bp和5 255 bp的2條片段，所得片段大小正確。應用BCL11B常規引物PCR擴增BCL11B基因，得到大小為193 bp的片段，所得到的片段大小正確，見圖1。

Figure 1.Identification of pIRES2-BCL11B-EGFP recombinant plasmid by electrophoresis analysis.M: 1 kb plus DNA marker; Lane 1: pIRES2-BCL11B-EGFP recombinant plasmid digested by XhoⅠ and BamHⅠ (2 479 bp and 5 255 bp); Lane 2: PCR product of BCL11B (193 bp); Lane 3: pIRES2- BCL11B-EGFP recombinant plasmid.

2重組質粒在K293細胞中的表達

2.1轉染效率檢測

利用熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察經脂質體轉染48 h后，K293細胞EGFP表達情況以明確轉染效率。結果表明，K293細胞的轉染效率較高，其中pBCL11B組的轉染效率為(71.23±4.62)％，pI2組的轉染效率為(70.45±3.58)％，而MOCK組則幾乎不表達EFGP，轉染效率為(0.30±0.10)％,見圖2。

Figure 2.Detection of the transfection efficiency in K293 cells by fluorescence microscopy(×100) and flow cytometry(FCM).A and B: pBCL11B (fluorescence microscopy); C: pBCL11B (FCM); D and E: pI2 (fluorescence microscopy); F: pI2 (FCM); G and H: MOCK (fluorescence microscopy); I: MOCK (FCM).

2.2mRNA和蛋白水平鑒定BCL11B的表達 Real-time PCR和Western blotting檢測結果顯示，K293細胞中，轉染重組質粒后pBCL11B組的BCL11B基因在mRNA和蛋白水平均能有效表達。在mRNA水平，用BCL11B在每105個β2M中的拷貝數代表BCL11B的絕對表達量，結果顯示：轉染后24 h pBCL11B組BCL11B的拷貝數為(1 237 167±1 32 571.0)/105個β2M拷貝，而pI2組和MOCK組BCL11B的拷貝數遠遠低于pBCL11B組，在30個拷貝/105個β2M拷貝以下，差異顯著(Plt;0.05),見表2。在蛋白水平，經Western blotting、DAB顯色及Image Quantition軟件灰度分析比對，用EGFP、BCL11B與內參β-actin的灰度比值代表蛋白表達相對量。結果顯示：在轉染后48 h，pBCL11B組、pI2組和MOCK組的EGFP蛋白的相對表達量分別為(2.01±0.12)、(2.89±0.37)和0，pBCL11B組和pI2組EGFP蛋白的表達無明顯差異，而這兩組與MOCK組相比，差異均顯著(Plt;0.05)。各組的BCL11B蛋白的相對表達量分別為(1.35±0.06)、(0.04±0.01)和(0.11±0.03)，pBCL11B組BCL11B蛋白表達量明顯高于其它2組(Plt;0.05)，見表2、圖3。

表2 K293細胞中各組BCL11B mRNA和蛋白表達情況

Figure 3.EGFP and BCL11B protein expression in K293 cells detected by Western blotting.

3重組質粒在Raji細胞中的表達

3.1轉染效率檢測 利用熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察經核轉染24 h后Raji細胞EGFP的表達情況。結果發現，懸浮細胞Raji的轉染效率要遠低于貼壁細胞K293，pBCL11B組的轉染效率為(23.12±5.94)％，pI2組的轉染效率為(22.48±6.25)％，而MOCK組則幾乎不表達EFGP，轉染效率為(0.30±0.10)％，見圖4。

Figure 4.Detection of the transfection efficiency in Raji cells by fluorescence microscopy(×100) and flow cytometry(FCM).A and B: pBCL11B (fluorescence microscopy); C: pBCL11B (FCM); D and E: pI2 (fluorescence microscopy); F: pI2 (FCM); G and H: MOCK (fluorescence microscopy); I: MOCK (FCM).

3.2mRNA和蛋白水平鑒定BCL11B的表達 Real-time PCR和Western blotting檢測結果顯示，Raji細胞中，轉染重組質粒后pBCL11B組的BCL11B基因在mRNA和蛋白水平均能有效表達。在mRNA水平，轉染24 h后pBCL11B組BCL11B的拷貝數為(21 244±1 370)/105個β2M拷貝，而pI2組和MOCK組BCL11B的拷貝數遠遠低于pBCL11B組，在1個拷貝/105β2M拷貝以下,見表3。而在蛋白水平，轉染后48 h，pBCL11B組、pI2組和MOCK組的EGFP蛋白的相對表達量分別為(0.40±0.03)、(0.35±0.07)和(0.02±0.01)，pBCL11B組和pI2組EGFP蛋白的表達無明顯差異，而這兩組與MOCK組相比，差異均顯著(Plt;0.05)。在轉染后48 h，pBCL11B組、pI2組和MOCK組的BCL11B蛋白的相對表達量分別為(0.390±0.050)、(0.007±0.002)和0，差異顯著(Plt;0.05)，見表3、圖5。

表3 Raji細胞中各組BCL11B mRNA和蛋白表達情況

Figure 5.EGFP and BCL11B protein expression in Raji cells detected by Western blotting.

3.3高分辨率活細胞成像系統動態觀測轉染后36-72 h期間pBCL11B組細胞變化情況 利用高分辨率活細胞成像系統在轉染后36-72 h不間斷連續觀測pBCL11B組Raji細胞中EGFP變化情況。圖6顯示，轉染后36 h某一個已經表達EGFP的Raji母細胞在轉染70 h后細胞形態及EGFP表達變化還不是很明顯，見圖6A、B，細胞處于有絲分裂前期的準備階段。而在70-72 h間，母細胞發生有絲分裂，并且子細胞也帶有EGFP,見圖6C、D。說明轉染了重組質粒的細胞可以正常增殖，并且，所分裂的子細胞也保留母細胞攜帶BCL11B重組質粒的性狀。

Figure 6.The changes of EGFP expression in Raji cells detected by the high-resolution live cell imaging system(×400).The arrangement of A-D presents the time course..

討 論

BCL11B基因的首次報道見于2000年[4]，10年來科研工作者對該基因的功能進行了研究。現已證實BCL11B基因編碼C2H2型鋅指蛋白，選擇性地結合特異性靶結構，調控基因的表達，但其作為轉錄因子的功能及作用的靶基因尚未完全明確。BCL11B基因既可以作為轉錄抑制因子與COUP-TF和NuRD的某些基序結合來抑制基因的表達[4,5]，也可以作為轉錄活化因子激活IL-2的表達[6]。最近的研究表明，BCL11B基因不僅與T細胞的發育、分化和存活密切相關，還是中樞神經系統[7]、皮膚[8]和牙齒[9]等器官發育所必須的基因。盡管動物實驗研究取得了一定的進展[1,2]，但BCL11B基因對于人類T細胞的作用仍少見報道，只有Grabarczyk等[3]曾利用靶向特異性siRNA下調正常人外周血BCL11B基因的表達，發現BCL11B表達的缺失對正常成熟T細胞無影響。為進一步研究BCL11B基因的功能，我們將構建成功的pIRES2-BCL11B-EGFP真核表達載體轉染至幾乎不表達BCL11B基因的K293和Raji細胞株中，試圖了解重組質粒在真核細胞中的表達情況，從而為下一步上調正常人T細胞的BCL11B基因表達提供實驗基礎。同時，本課題組也設計、合成了針對BCL11B基因的序列特異性小干擾RNA(siRNA)，下調高表達BCL11B基因的腫瘤性T細胞株Molt-4細胞中BCL11B基因的表達，研究對細胞增殖、凋亡產生的影響[10]。siRNA也將用于下調正常人T細胞的BCL11B基因表達，以期全面評價BCL11B基因對人T細胞的影響。

基因轉染技術是將目的基因轉入某一細胞中，通過觀察細胞生物學功能的變化來認識目的基因的功能，是目前應用最多、技術最成熟的基因功能研究方法[11]。目前常用的基因轉染系統包括病毒性表達系統和非病毒性表達系統2種。病毒性載體具有轉染效率高、目的基因可穩定表達等優勢，但存在生物安全性等問題。非病毒性表達載體目前主要采用質粒，通過脂質體介導和電穿孔等方法使目的基因被宿主細胞攝取。脂質體轉染方法的主要問題是，不同細胞類型對外源DNA的攝取能力有所不同，對于懸浮細胞和原代細胞轉染效果較差。本研究中我們首先利用脂質體轉染方法轉染貼壁細胞K293，效果理想，轉染效率在70％以上。同時，我們嘗試用脂質體方式轉染懸浮細胞Raji，轉染效率不超過5％。隨后，我們選擇了核轉染的方法對Raji細胞進行轉染。核轉染技術是將傳統的電穿孔方法和具有細胞特異性的轉染緩沖液結合起來，針對不同的細胞類型，采用不同的經過優化的配套轉染試劑和轉染程序，在達到最理想的轉染效率的同時保持細胞的活力。其最大優點是可以直接將外源核酸同時輸送細胞核內，特別適用于轉染原代細胞和難于轉染的懸浮細胞系，且減少了使用病毒載體帶來的生物安全性問題。這項技術的高轉染效率和低毒性使轉基因的細胞表現出較強的活力以及外源基因在細胞內穩定表達。本研究利用核轉染的方法使較難轉染的懸浮細胞Raji得到了較高的轉染效率，證實了核轉染的有效性，為今后通過此方法轉染人原代T細胞提供了實驗基礎。

本研究共設立了2個對照組，分別是空質粒對照pI2和轉染條件對照MOCK，以判斷質粒本身和轉染條件對細胞的影響。轉染后對目的基因表達的檢測時間一般在24到48 h，最佳時間取決于被表達的基因本身、可用的檢測靈敏度以及在載體中調控表達的元件等，通常在24 h對mRNA水平進行檢測、48 h對蛋白水平進行檢測。本研究的結果顯示2種細胞均能在轉染后的24 h和48 h分別檢測到BCL11B基因在mRNA和蛋白水平的表達，從而證明了重組質粒可以在真核細胞中有效表達。此外，本研究還首次利用了高分辨率活細胞成像系統動態監測了轉染36-72 h期間Raji細胞中pBCL11B組EGFP變化情況。結果顯示在某一個已經表達EGFP的Raji細胞在發生有絲分裂時，其子細胞也帶有EGFP，這說明轉染了重組質粒的細胞可以正常增殖，且所分裂的子細胞保留了母細胞的性狀。

總之，本研究分別通過脂質體和核轉染的方法比較系統地分析了pIRES2- BCL11B-EGFP重組質粒在不同細胞株轉染的效率、基因和蛋白表達水平，以及隨著細胞增殖BCL11B基因的表達變化等，為分析基因轉導提供一些可行技術方法，更為進一步上調正常人T細胞及研究BCL11B的功能提供基礎資料。

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DynamicanalysisofinvitroexpressionofB-celllymphoma/leukemia11BgenebyeukaryoticexpressiveplasmidpIRES2-EGFP-BCL11B

CHEN Si1,2,HUANG Xin1,YANG Li-jian1,CHEN Shao-hua1,ZHENG Hai-tao1,SHEN Qi1,LI Bo1,LI Yang-qiu1,3

(1InstituteofHematology,SchoolofMedicine,3KeyLaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEducation,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofImmunology,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China.E-mail:jnyangqiuli@163.com)

AIM: To analyze the ability of eukaryotic expressive plasmid pIRES2-EGFP-BCL11B to express B-cell lymphoma/leukemia 11B(BCL11B) gene in K293 and Raji cells.METHODSThe eukaryotic expressive plasmid pIRES2-BCL11B-EGFP (pBCL11B) was transfected into K293 cells and Raji cells by the techniques of Lipofectamine and Nucleofector transfection,respectively.Empty plasmid (pI2) and mock-transfection (MOCK) were used as controls.The transfection efficiency was examined by the methods of fluorescence microscopy and flow cytometry 48 h after transfection.The mRNA expression of BCL11B was analyzed at 24 h by real-time quantitative PCR with Taqman technique.The protein levels of BCL11B were determined at 48 h by Western blotting.The expression of recombinant plasmid during proliferation of Raji cells transfected with pIRES2-EGFP-BCL11B were observed by the high-resolution live cell imaging system from 36 h to 72 h.RESULTSThe transfection efficiency in pBCL11B,pI2 and MOCK groups in K293 cells was (71.23±4.62)％,(70.45±3.58)％ and (0.30±0.10)％,respectively.Simultaneously,that in Raji cells was(23.12±5.94)％,(22.48±6.25)％ and (0.30±0.10)％,respectively.Compared with pI2 and MOCK controls,the mRNA and the corresponding proteins of theBCL11Bgene were effectively in up-regulated pBCL11B group (Plt;0.05).The results of high-resolution live cell imaging system showed that the recombinant plasmid stably expressed EGFP protein from 36 h to 72 h after transfection,and the transfected cells proliferated normally.CONCLUSIONBCL11B gene is effectively up-regulated in K293 and Raji cells after transfected with pIRES2-BCL11B-EGFP eukaryotic expressive plasmid,indicating a useful way for subsequent step in human T-cells transfection.

Genes,BCL11B; Eukaryotic expression vector; K293 cells; Raji cells

1000-4718(2011)05-0944-07

R733.73

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.021

2010-08-31

2011-03-17

國家自然科學基金資助項目(No.30771980)；廣東省科技計劃資助項目(No.2007B030703008;No.2009B050700029)

△通訊作者 Tel: 020-85226877; E-mail: jnyangqiuli@163.com