磷酸肌酸鈉對阿霉素所致心肌損傷的影響*

趙文英， 陳冬云， 齊 全

(皖南醫學院附屬弋磯山醫院腫瘤內科,安徽 蕪湖 241000)

磷酸肌酸鈉對阿霉素所致心肌損傷的影響*

趙文英△， 陳冬云， 齊 全

(皖南醫學院附屬弋磯山醫院腫瘤內科,安徽 蕪湖 241000)

目的： 探討磷酸肌酸鈉對阿霉素所致小鼠心肌損傷的保護作用及機制。方法60只雌性BALB/c小鼠隨機分為磷酸肌酸鈉干預組、阿霉素組和正常對照組，觀察小鼠的一般情況，檢測血清中肌鈣蛋白I(TnI)、N端前腦鈉肽(NT-proBNP)及心肌組織中丙二醛(MDA)、ATP酶的變化，心肌細胞凋亡及心肌組織bcl-2、fas基因的表達。結果與對照組及磷酸肌酸鈉組比較，阿霉素組心肌細胞發生明顯的水腫變性，并可見部分細胞凋亡，凋亡指數增大(Plt;0.05)；阿霉素組MDA明顯增高 (Plt;0.05)，ATP酶活力降低(Plt;0.05)；血清中TnI和NT-proBNP有增高的趨勢(Pgt;0.05)；磷酸肌酸鈉組與阿霉素組比較，bcl-2基因表達增多，fas基因表達減少(Plt;0.05)。結論磷酸肌酸鈉對阿霉素所致的心肌損傷具有保護作用，其機制可能與磷酸肌酸鈉減少氧自由基和抑制細胞凋亡有關。

磷酸肌酸鈉； 阿霉素； 細胞凋亡； 自由基

阿霉素(adriamycin，ADR)是一種廣譜高效蒽環類抗腫瘤藥物，在臨床應用廣泛。由于ADR與心肌組織的親和力明顯高于其它組織，具有嚴重的心臟毒性并具劑量依賴性，從而嚴重限制其臨床應用[1]。長期使用 ADR對心臟的慢性毒性作用主要是與累積劑量有關的擴張性心肌病和充血性心力衰竭，常規藥物治療效果不理想，預后很差。其確切的病因機制尚未明確，有研究認為，ADR導致心肌損傷與其半醌自由基介導的氧自由基損傷有關[2]。磷酸肌酸作為細胞內的一種高能磷酸化合物，不僅可以在心肌細胞遭受缺血缺氧時為其提供能量，還可以保護心肌細胞膜免受氧自由基等有害物質的侵襲[3]。研究發現，磷酸肌酸可以透過細胞膜抑制膜通透性、改變孔道的開放以保護線粒體，減少細胞凋亡[4]。本實驗選用小鼠作為研究對象，建立阿霉素心肌病動物模型，予以磷酸肌酸鈉干預治療，為臨床有效治療阿霉素引起的心肌病提供理論依據。

材 料 和 方 法

1動物和試劑

健康6周齡雌性BALB/c小鼠60只，體重 (20±2)g，由南京醫科大學實驗動物中心提供[許可證號為SCXK(蘇)2007-0001]。阿霉素由浙江海正藥業有限公司生產(批號為20100423)，注射用磷酸肌酸鈉由吉林英聯生物技術有限公司生產(批號為20091007)。ATP酶試劑盒及丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒均購自南京凱基生物工程研究所。小鼠心肌肌鈣蛋白(troponin I,TnI)、N端前腦鈉肽(amino-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)酶聯免疫試劑盒購自上海研吉生物科技有限公司。TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒購自上海生研生物科技有限公司。

2動物分組

健康6周齡雌性BALB/c小鼠，適應性喂養后，隨機分為3組(每組20只)：(1)正常對照組(contro1組)：每3 d尾靜脈注射生理鹽水(NS)10 mL/kg，共10次；(2)阿霉素組(ADR組)：每3d尾靜脈注射同容量的ADR 2 mg/kg，共10次,累積劑量20 mg/kg[5,6]；(3)磷酸肌酸鈉組(sodium phosphocreatine,CP組)：每3 d尾靜脈注射同容量的 ADR 2 mg/kg，共10次,累積劑量20 mg/kg，第6次時開始注射磷酸肌酸鈉200 mg·kg-1·d-1，共12 d。

3標本收集

小鼠固定后，摘取眼球，取眶靜脈血，制備血清。采血后，迅速開胸取出心臟，取部分心臟用于免疫組化和bcl-2、fas基因表達檢測。

4觀察項目與方法

4.1癥狀及體征 觀察一般精神狀況，飲食，皮毛和體重情況等。

4.2小鼠血清TnI、NT-proBNP及心肌組織中ATP酶、MDA的測定 采血后，4℃，3 000 r/min 離心后取上清，用于檢測小鼠血清TnI和NT-proBNP的含量。摘除心臟后用生理鹽水沖洗干凈，稱取約0.5 g心肌組織置勻漿器中，在0 ℃條件下制備組織勻漿，離心后取上清用于檢測ATP酶活性及MDA含量，所有操作均按照試劑盒說明書進行。

4.3組織病理學檢查 4％甲醛固定24 h的心肌組織用石蠟包埋，切成5 μm左右薄片，用蘇木精-伊紅進行染色。隨機選擇任意1張片的10個視野用彩色影像分析儀進行分析。組織學病變以心肌纖維消失及胞漿空泡變性程度來判定 (計分0-3)。

4.4細胞凋亡檢測 TUNEL細胞凋亡原位檢測按試劑盒說明書操作。(1)石蠟切片脫蠟至水化，PBS沖洗3 min×3次;(2)蛋白酶K消化15 min，PBS沖洗3 min×3次;(3)擦干組織周圍水分，滴加血清(羊抗) 5 min，甩干(以減少非特異性結合);(4) 滴加25-50 μL的TUNEL反應液，37℃孵育60 min，PBS沖洗3 min×3次;(5)0.3％H2O2阻斷，37 ℃濕盒中孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次；(6) 滴加DAB底物溶液，室溫5-10 min；蘇木素復染、脫水、封片。細胞核呈棕黃色為TUNEL反應陽性細胞(即凋亡細胞)，光鏡下分析結果，隨機計數5個高倍視野下陽性細胞所占百分數即為細胞凋亡指數。

4.5半定量RT-PCR方法檢測bcl-2和fas基因的表達 Trizol法提取心肌組織中的總RNA。利用RT-PCR kit(Carpentaria)合成 cDNA，設計GAPDH、bcl-2及fas基因相對應的引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)后進行 PCR(引物序列見表1)。PCR條件分別為GAPDH：預變性94 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s、 58 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個循環,72 ℃ 5 min；4 ℃保存。bcl-2：預變性94 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個循環,72 ℃ 5 min；4℃保存。fas：預變性94 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s、56 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s，35個循環,72 ℃ 5 min；4 ℃保存。bcl-2、fas的PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳后溴乙啶染色，用Bio-Rad凝膠成像分析系統分析并取得積分吸光度值，然后用同樣方法得出的GAPDH值來校正。

表1 bcl-2、 fas和GAPDH引物序列及RT-PCR產物大小

5統計學處理

結 果

1小鼠的一般狀況

正常對照組及CP組小鼠攝食、活動、糞便等一般狀況良好，皮毛光滑；ADR組小鼠出現進食明顯減少、活動遲緩、豎毛。

2小鼠血清TnI、NT-proBNP含量及心肌組織MDA含量、ATP酶活性的變化

阿霉素組與正常組、磷酸肌酸鈉組比較MDA含量升高，ATP酶活性下降(Plt;0.05)，血清TnI和NT-proBNP的含量有升高的趨勢，但無顯著差異(Pgt;0.05)，見表2。

表2 小鼠TnI、NT-proBNP、MDA含量及ATP酶活性的變化

3心肌組織結構的改變

HE染色后，正常對照組：心肌組織未見明顯變性； 阿霉素組：心肌組織的部分心肌細胞腫脹肥大明顯，細胞內可見均勻的細小紅染顆粒，并伴有水樣變性(變性評分2-3分)，見表3；磷酸肌酸鈉組：心肌組織少部分心肌細胞腫脹肥大，細胞輕度水樣變性(變性評分1-2分),見表3、圖1。

4心肌細胞凋亡指數的變化

正常對照組：心肌組織未見明顯細胞凋亡改變，凋亡指數(16.23±6.11)％；阿霉素組：心肌組織中部分心肌細胞內可見棕黃色顆粒、凋亡小體及碎片，凋亡指數(28.02±6.50)％；磷酸肌酸鈉組：心肌組織少部分心肌細胞內可見棕黃色顆粒，凋亡指數(20.60±5.48)％；阿霉素組凋亡指數與正常對照組、磷酸肌酸鈉組比較差異顯著(Plt;0.05)，見表3、圖2。

表3 小鼠心肌組織細胞水腫分級及細胞凋亡指數

Figure 1.Histological changes of cardiac tissues in mice(HE staining,×400).A: contro1 group；B: ADR group；C: CP group.

Figure 2.Apoptosis were observed by TUNEL(×400).A: contro1 group；B: ADR group；C: CP group.Intracellular edema,nuclear degeneration and apoptotic bodies(black arrow) were observed in ADR group.There was no significant change in the control and CP group.

5小鼠心肌組織中的bcl-2、fas基因的表達變化

與正常組及磷酸肌酸鈉組比較，阿霉素組的bcl-2基因的表達降低(Plt;0.05)，fas基因表達升高(Plt;0.05);說明磷酸肌酸鈉可增加bcl-2基因表達，同時抑制fas基因表達,見圖3。

Figure 3.The expression of bcl-2 and fas mRNA in mouse cardiac tissues was exzamined by RT-PCR.A,B:the electrophoretogram of RT-PCR; C,D:the homologous optical density scanning±s.n=20.*Plt;0.05 vs control group and CP group.M:marker;CON: control; ADR: adriamycin; CP: sodium phosphocreatine .

討 論

眾所周知，bcl-2基因是一有抑制細胞凋亡作用的基因，主要分布在線粒體內膜、細胞膜內表面等處。Wu等[9]用ADR處理培養的乳鼠心肌細胞，發現細胞內的bcl-2表達下降，與ADR的劑量有關。Fas蛋白是細胞膜上的跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體家族。Nakamura等[10]在ADR大鼠心肌中證實，細胞凋亡由Fas途徑介導，抗Fas 的抗體能抑制ADR誘導的細胞凋亡，從而改善心功能。本實驗亦發現阿霉素可使心肌細胞bcl-2基因表達減少，fas基因表達增加；阿霉素組細胞凋亡指數較正常對照組及磷酸肌酸鈉組升高，提示阿霉素引起的心肌細胞損傷與細胞凋亡密切相關。

磷酸肌酸鈉是人體內自有的活性物質，是人體重要的能量供應源，為ATP補充能量，而 ATP是任何細胞代謝過程中最主要的能量源。本實驗中發現磷酸肌酸鈉能顯著降低氧自由基的產生，并提高ATP酶的活力，減輕細胞膜的脂質過氧化及細胞內鈣超載，使心肌細胞損傷減輕。Broeyer等[11]研究顯示阿霉素心肌病可引起心肌酶TnI及NT-proBNP水平升高，是反映心肌損傷嚴重程度的敏感指標，在實驗中用磷酸肌酸鈉干預組心肌細胞水腫不明顯，血清中肌鈣蛋白及前腦鈉肽較阿霉素組有下降趨勢，提示磷酸肌酸鈉可作為一種高效供能物質對心肌細胞在代謝和功能上具有保護作用，減輕阿霉素引起的心肌損傷，改善心功能。

綜上所述，磷酸肌酸鈉對阿霉素心肌病的保護作用機制可能為：(1)進入細胞參與高能磷酸肌酸水平的維持；(2)提供能量，減少氧自由基的產生及細胞內鈣超載對細胞的損傷；(3)通過調節bcl-2及fas基因的表達減少細胞凋亡。本研究為臨床預防和治療阿霉素心肌病提供理論依據，值得在臨床進一步研究。

[1]Lipshultz SE,Lipsitz SR,Sallan SE,et al.Chronic progressive cardiac dysfunction years after doxorubicin therapy for childhood acute lymphoblastic leukemia[J].J Clin Oncol,2005,23(12):2629-2636.

[2]Mordente A,Meucci E,Silvestrini A,et al.New developments in anthracycline-induced cardiotoxicity[J].Curr Med Chem，2009,16(13):1656-1672.

[3]毛東偉，朱世軍，趙玉娟，等．缺血預處置及磷酸肌酸對心肌缺血再灌注羥自由基生成的影響[J]．中國病理生理雜志，1999,15(4):350-352.

[4]Nakae I，Mitsunami K，Omura T，et a1．Proton magnetic resonance spectroscopy can detect creatine depletion associated with the progression of heart failure in cardiomyopathy[J]．Am Coll Cardiol，2003,42(9):1587-1593．

[5]劉洪智，高傳玉，曹林生，等.阿霉素心肌病大鼠模型的建立及評價[J].武漢大學學報：醫學版，2007,28(4):500-503.

[6]李玉玲，楊建業，唐俊明，等.阿霉素誘導大鼠心衰模型不同方案的比較[J].中國比較醫學雜志，2006,16(2):93-96.

[7]張亞臣，容燁之，趙美華，等．阿霉素中毒心肌細胞脂質過氧化及其導致的鈣超負荷的研究[J]．中國病理生理雜志，1998,14(6):688-690.

[8]Kalyanaraman B,Joseph J,Kalvedis AD,et al.Doxorubicin-induced apoptosis:implication in cardiotoxicity[J].Mon Cell Biochem,2002,234(2):119-124.

[9]Wu S,Ko YS,Teng MS,et al.Adriamycin-induced cardiomyocyte and endothelial cell apoptosis:invitrostudies[J].J Mol Cell Cardiol,2002,34(12):1595-1607.

[10]Muraoka S,Miura T.Free radical mediate cardiac toxicity induced by adriamycin[J].Yakugaku Zsshi,2003,123(10):855-866.

[11]Broeyer FJ,Osanto S,Ritsema van Eck HJ,et al.Evaluation of biomarkers for cardiotoxicity of anthracycline-based chemotherapy[J].J Cancer Res Clin Oncol,2008,134(9):961-968.

多胺類對爪蟾屬蝌蚪癲癇模型的神經保護作用

癲癇發作易損傷發育的中樞神經系統(CNS)。內源性的多胺(如腐胺、精脒和精胺)廣泛存在于CNS，與神經性的細胞損傷有關，但其作用是減弱還是增強細胞損傷還不清楚。多胺類可作用于離子通道NMDA受體、鉀通道和鈣通道AMPA受體從而調節神經元的興奮性。而神經元活性可快速調節多胺的合成和降解。神經元活性增強時，多胺合成的限速酶 - 鳥苷酸脫羧酶活性亦增強，從而導致多胺合成迅速增加。美國科學家用戊撐四唑(pentylenetetrazole，PTZ，一種驚厥劑)處理爪蟾屬蝌蚪癲癇發作模型時發現，經PTZ首次處理后，第2次使用PTZ所致癲癇發作的起始時間比首次作用晚約4 h，這種保護作用是由于癲癇發作后腐胺(一種最簡單的多胺)合成增多所致。腐胺不是通過直接調節離子通道，而是通過使神經元由興奮變為抑制而發揮作用。癲癇首次發作4 h后記錄頂蓋神經元，發現 -氨基丁酸能(GABAergic)神經元自發性的抑制性突觸后電位放電頻率增加。實驗證實，腐胺通過一種非經典途徑轉化生成 -氨基丁酸(GABA)，GABA激活抑制性中間神經元突觸前GABAB受體，GABAB受體的激活使抑制性神經元代償性的上調GABA的釋放，從而產生這一效應。當腐胺和GABA的量恢復到正常水平時，抑制性的放電頻率仍處于高水平。若此時癲癇再次發作，動物就會受到保護。目前尚不知癲癇發作后腐胺和(或)GABA是如何轉運的。總之，癲癇發作時，多胺類對發育的大腦具有神經保護作用。

Nat Neurosci,2011,14(4):505-512(朱小青)

Effectofsodiumphosphocreatineonadriamycin-inducedcardiotoxicity

ZHAO Wen-ying,CHEN Dong-yun,QI Quan

(DepartmentofMedicalOncology,YijishanHospital,WannanMedicalCollege,Wuhu241000,China.E-mail:zhaowy98@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the effect of sodium phosphocreatine on adriamycin-induced cardiotoxicity in mice.METHODSSixty female BALB/c mice weighing about 20 g were randomly divided into control group,adriamycin group and sodium phosphocreatine treatment group.The general conditions of the mice were observed.The content of amino-terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP) and troponin I(TnI) in serum,the changes of malondialdehyde(MDA) concentration and ATPase activity in cardiac tissues were detected.The anti-apoptotic effect of sodium phosphocreatine was also evaluated byinsituterminal dUTP nick-end labeling (TUNEL).The mRNA levels ofbcl-2 andfaswere detected by RT-PCR.RESULTSThe intracellular edema,nuclear degeneration and apoptosis were observed in the cardiac tissues in adriamycin-treated mice.Compared with control group and sodium phosphocreatine treatment group,the apoptosis index was increased,the MDA concentrations were elevated and the activity of ATPase was decreased in mouse cardiac tissues in adriamycin group.The serum levels of TnI and NT-proBNP were increased,the expression ofbcl-2 was promoted and the expression offaswas inhibited in sodium phosphocreatine treatment group as compared to adriamycin group.CONCLUSIONSodium phosphocreatine protects mice from adriamycin-induced cardiotoxicity by reduction of oxygen free radicals and apoptosis in mouse cardiac tissues.

Sodium phosphocreatine; Adriamycin; Apoptosis; Free radicals

1000-4718(2011)05-0939-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.020

2010-12-23

2011-03-21

安徽省高等學校省級自然科學基金資助項目(No.KJ2010B252)

△通訊作者Tel：0553-5711589;E-mail：zhaowy98@yahoo.com.cn