小凹蛋白-1在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CaR介導(dǎo)NO生成中的作用和機(jī)制*

王振煥， 胡清華， 鐘 華， 鄧峰美， 陳雄英， 孫志萍， 何 芳△

(1新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2病理生理教研室，3醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，新疆 石河子 832002；4華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，衛(wèi)生部呼吸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430030)

小凹蛋白-1在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CaR介導(dǎo)NO生成中的作用和機(jī)制*

王振煥1,2， 胡清華3， 鐘 華1,2， 鄧峰美1,2， 陳雄英1,2， 孫志萍4， 何 芳1,2△

(1新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院2病理生理教研室，3醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，新疆 石河子 832002；4華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，衛(wèi)生部呼吸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430030)

目的： 探討小凹蛋白-1(Cav-1)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)鈣敏感受體(CaR)介導(dǎo)NO生成中的作用和機(jī)制。方法利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將構(gòu)建的Cav-1干擾質(zhì)粒(Cav-1 shRNA)轉(zhuǎn)染入HUVECs，隨機(jī)分為：(1) 對(duì)照組；(2)CaR激動(dòng)劑 (精胺)組；(3) 精胺+Ca2+組；(4) CaR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(Calhex231)+精胺組；(5) Calhex231+精胺+Ca2+組；(6) 非律平(filipin)+精胺組；(7) filipin+精胺+ Ca2+組；(8)空質(zhì)粒 (vehicle)+精胺+Ca2+組；(9) Cav-1 shRNA+精胺組；(10) Cav-1 shRNA+精胺+Ca2+組。Western blotting檢測(cè)Cav-1 shRNA轉(zhuǎn)染后HUVECs中CaR和Cav-1蛋白表達(dá)，通過NO熒光探針DAF-FM DA負(fù)載HUVECs檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO的生成；并在提供充足底物的條件下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性。結(jié)果Cav-1干擾后，Cav-1蛋白表達(dá)降低，同時(shí) CaR的膜蛋白表達(dá)降低(Plt;0.05)，CaR的漿蛋白表達(dá)無變化(Pgt;0.05)。無論細(xì)胞外為零鈣液或含鈣液時(shí)，精胺(2 mmol/L)刺激CaR時(shí)均引起eNOS活性和NO含量增加(Plt;0.05)，其中細(xì)胞外液為含鈣液時(shí)，eNOS活性和NO含量增加較細(xì)胞外為零鈣液時(shí)更明顯(Plt;0.05)，Calhex231 (1 μmol/L)可阻斷(細(xì)胞外為零鈣液)或降低(細(xì)胞外液為含鈣液) 精胺介導(dǎo)的上述作用 (均Plt;0.05)；此作用亦可被filipin (1.5 mg/L)或Cav-1基因沉默減弱(細(xì)胞外液為含鈣液) (均Plt;0.05)。結(jié)論HUVECs中Cav-1對(duì)CaR介導(dǎo)的NO生成有促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與Cav-1影響CaR膜定位及對(duì)激動(dòng)劑反應(yīng)性有關(guān)。

小凹蛋白-1； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 受體，鈣敏感； 一氧化氮

生理?xiàng)l件下，NO主要源于內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular Ca2+concentration，[Ca2+]i)增加為激活eNOS的重要條件；而小凹蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)為eNOS的負(fù)調(diào)控蛋白，也是小凹(caveolae)表面標(biāo)志蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白[1]。鈣敏感受體(Ca2+-sensing receptor， CaR)為G蛋白偶聯(lián)受體C家族的II型受體。該受體激活后經(jīng)磷脂酶C (phospholipase C,PLC)，增加胞內(nèi)三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-triphosphate,IP3)和二磷酸甘油(diphosphoglycerate,DAG),使[Ca2+]i升高，抑制甲狀旁腺素的分泌，在維持全身鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[2,3]。此外，CaR在影響NOS活性和NO生成中也發(fā)揮重要作用。人主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中功能性的CaR表達(dá)，在CaR激動(dòng)劑精胺的刺激下，引起[Ca2+]i增加和NO生成[4,5]。如上所述，Ca2+為激活eNOS生成NO的重要輔助因子，而Cav-1是介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流重要的支架蛋白，又是eNOS的負(fù)調(diào)控蛋白。同時(shí)，文獻(xiàn)已證實(shí)Cav-1為CaR的相互作用蛋白之一。在培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞株(Saos-2)，Cav-1與CaR相互結(jié)合，Cav-1可上調(diào)CaR的功能[6,7]。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)有CaR和Cav-1表達(dá)，兩者共定位于膜上，Cav-1對(duì)CaR介導(dǎo)的鈣內(nèi)流有下調(diào)作用(資料已整理投稿)。那么，在HUVECs，CaR激活后是否具有介導(dǎo)NO生成作用，Cav-1對(duì)此有何種調(diào)節(jié)作用?有待證實(shí)。

本課題在前期研究基礎(chǔ)上，以原代培養(yǎng)的HUVECs為研究對(duì)象，觀察了CaR激動(dòng)劑精胺(spermine)和負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex231處理后HUVECs中eNOS活性和NO生成變化，以及Caveolae結(jié)構(gòu)破壞劑非律平(filipin)或Cav-1基因沉默后對(duì)HUVECs中eNOS活性和NO生成影響，試圖闡明Cav-1在CaR介導(dǎo) NO生成中作用和機(jī)制，為心腦血管疾病防治提供新思路 。

材 料 和 方 法

1主要材料和試劑

1.1主要試劑 健康孕婦剖宮產(chǎn)的新鮮臍帶(來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，經(jīng)倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)和個(gè)人知情同意)；胰酶(Sigma)；M199 (Thermo)；胎牛血清(Gibco)； 細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM,ScienCell)；明膠(Sigma)；精胺(Sigma)；filipin (Sigma)； Calhex231 (Sigma)；Cav-1Ⅰ抗(Cell Signaling Technology)；CaRⅠ抗(Affinity BioReagents,ABR)；β-actin抗體(Santa Cruz)；ECL發(fā)光試劑盒(Thermo)；LipofectamineTM2000 (Invitrogen)；Cav-1shRNA質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P公司)；G418 (Biosharp)；NOS和NO檢測(cè)試劑盒(Beyotime)；去內(nèi)毒素高純度質(zhì)粒抽提試劑盒(Omega)。

2方法

2.1HUVECs的培養(yǎng)與鑒定 依據(jù)本研究室以前的研究方法培養(yǎng)HUVECs，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)及對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ⅷ因子進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色來鑒定是否為HUVECs。取2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 按照以下方式分組處理，并持續(xù)灌流20 min，其中細(xì)胞外不含鈣離子組和含鈣離子組分別用Ca2+-free HBS溶液和含2 mmol/L Ca2+的HBS溶液將藥物配制成不同濃度灌流：(1) 對(duì)照組；(2) spermine (2 mmol/L)組；(3) spermine + Ca2+組；(4) Calhex231 (1 μmol/L) + spermine組；(5) Calhex231+spermine+Ca2+組；(6) filipin (1.5 mg/L)+spermine組；(7) filipin+spermine+ Ca2+組；(8) 轉(zhuǎn)染組:又分為空白對(duì)照組(Control 組)，vehicle 組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒， Cav-1 shRNA組：轉(zhuǎn)染靶向Cav-1基因的siRNA，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加精胺(2 mmol/L)或精胺(2 mmol/L)+Ca2+(2 mmol/L)，按照下述方法檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

2.3質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 (1)質(zhì)粒構(gòu)建：由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建pGCsi-U6/Neo/DsRed重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序證實(shí)了克隆的RNAi打靶序列100％正確。(2)轉(zhuǎn)染：待細(xì)胞生長(zhǎng)至70％-90％融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為：未轉(zhuǎn)染組即空白對(duì)照組(control組)、空質(zhì)粒組(vehicle組)和特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組即實(shí)驗(yàn)組(Cav-1shRNA組)，按照LipofectamineTM2000操作說明書進(jìn)行。質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)增和純化，制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將該復(fù)合物與HUVECs混合，完成HUVECs轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24-48 h后，熒光顯微鏡下觀察到RFP，加入G418 (200 mg/L)進(jìn)行篩選，待未表達(dá)抗性基因的細(xì)胞被殺死后，將G418 改為100 mg/L維持1周。

2.4Western blotting檢測(cè)HUVECs Cav-1和CaR蛋白表達(dá) 棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗后，加入裂解液，提取細(xì)胞漿蛋白和膜蛋白，BCA 試劑測(cè)定蛋白含量，電泳，半干轉(zhuǎn),然后封閉，分別加入Cav-1 (1∶1 000)和CaR (1∶500)的Ⅰ抗，孵育過夜。第2 d用TBST洗膜3次各20 min,加入相應(yīng)的Ⅱ抗 (1∶1 000)搖床上孵育1.5 h，TBST洗膜3次各20 min；ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色,顯影定影處理，獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.5eNOS活性的測(cè)定 當(dāng)接種于96孔板的HUVECs達(dá)80％融合時(shí)，把96孔板里的培養(yǎng)基吸盡后加入100 μL含有eNOS抑制劑的NOS的檢測(cè)緩沖液，輕輕搖勻。再加入100 mL檢測(cè)反應(yīng)液，輕輕搖勻。37 ℃孵育箱中孵育30 min。直接把96孔板放到多功能酶標(biāo)儀上，以沒有細(xì)胞的孔為空白對(duì)照，激發(fā)波長(zhǎng)為495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm。eNOS活性用eNOS相對(duì)熒光強(qiáng)度(relative fluorescence unit,RFU)表示，其計(jì)算公式如下：eNOS相對(duì)活性=RFU已刺激-RFU抑制劑+已刺激)/(RFU未刺激-RFU抑制劑+未刺激)。

2.6NO含量的檢測(cè) 按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行，待細(xì)胞達(dá)80％融合時(shí)，按1∶2 000比例，用 DAF-FM DA熒光探針稀釋液稀釋DAF-FM DA，取200 μL稀釋后的DAF-FM DA，37 ℃孵育細(xì)胞15 min后，用HBS溶液反復(fù)沖洗。將灌流槽放于倒置熒光顯微鏡(Olympus XI70)上，以沒有細(xì)胞的孔為空白對(duì)照，同時(shí)用495 nm激發(fā)波長(zhǎng)，515 nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)、逐時(shí)點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱，并通過IPA Software進(jìn)行分析。NO含量用相對(duì)熒光強(qiáng)度RFU計(jì)算：NO含量=(測(cè)定孔曲線最高RFU -最低RFU)-(空白孔曲線最高RFU-最低RFU)。熒光強(qiáng)度應(yīng)用Image-Pro Plus 5.0分析。在胞外液是零鈣液時(shí)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不能維持到預(yù)定的檢測(cè)時(shí)間60 min，只能檢測(cè)20 min，這與Jung等[7]的研究血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)Ca2+內(nèi)流是釋放NO所必須的結(jié)果一致，因此圖中不含鈣離子的各組檢測(cè)時(shí)間為20 min。各組分別減去空白對(duì)照組(背景熒光)的NO熒光強(qiáng)度值后為NO凈熒光強(qiáng)度值，以此表示NO含量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1HUVECs的培養(yǎng)與鑒定

原代細(xì)胞放入培養(yǎng)箱后12 h，在倒置顯微鏡下觀察融合的HUVECs呈典型的鋪路石或鵝卵石樣排列；對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ⅷ因子進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，95％以上的細(xì)胞呈陽(yáng)性著色，證實(shí)細(xì)胞為HUVECs(資料未顯示)。

2小凹結(jié)構(gòu)破壞對(duì)HUVECs中Cav-1蛋白表達(dá)影響

同一代HUVECs分為4組：即對(duì)照組(control)、不同濃度加藥組(1.5 mg/L、2 mg/L和2.5 mg/L filipin組)，HUVECs經(jīng)不同濃度filipin處理6 h后提取HUVECs的漿蛋白，采用Western blotting檢測(cè)Cav-1蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示對(duì)照組、1.5 mg/L、2 mg/L及2.5 mg/L filipin組中Cav-1的蛋白含量相對(duì)值為1.56±0.01、1.53±0.01、1.49±0.01和1.57±0.02，各加藥組與對(duì)照組相比，無顯著差異(Pgt;0.05)，見圖1。

Figure 1.Effects of different concentrations of filipin on the expression of Cav-1 protein in HUVECs after 6-hour incubation±sE.n=3.

3Cav-1干擾后HUVECs中Cav-1和CaR蛋白表達(dá)

提取轉(zhuǎn)染48 h、用G418 (200 mg/L)進(jìn)行篩選7 d后HUVECs的漿蛋白和膜蛋白，與對(duì)照組比較，可見Cav-1 shRNA 組中Cav-1蛋白表達(dá)降低(抑制率為70％，Plt;0.05)，vehicle 組Cav-1蛋白表達(dá)無明顯變化(Pgt;0.05)。同時(shí),Cav-1 shRNA 組中CaR的膜蛋白表達(dá)降低(抑制率為20％，Plt;0.05)，CaR的漿蛋白表達(dá)無明顯變化(Pgt;0.05)， vehicle 組CaR的膜蛋白和漿蛋白表達(dá)均無明顯變化(Pgt;0.05)，見圖2。

Figure 2.Effect of shRNA targeted to Cav-1 on Cav-1 and CaR protein expression in HUVECs detected by Western blotting±sE.n=3.△Plt; 0.05 vs control; #Plt; 0.05 vs vehicle.

4不同處理因素刺激下HUVECs內(nèi)eNOS活性的變化

各組HUVECs培養(yǎng)48 h后加處理因素檢測(cè)，與對(duì)照組相比，精胺組eNOS活性升高；與精胺組相比，精胺+Ca2+組eNOS活性進(jìn)一步升高(Plt;0.05)，Calhex231 +精胺組eNOS活性降低(Plt;0.05)，filipin+精胺組及Cav-1 shRNA+精胺組eNOS活性均無顯著差異(Pgt;0.05)。與精胺+ Ca2+組相比，Calhex231+精胺+Ca2+組、filipin+精胺+Ca2+組及Cav-1 shRNA+精胺+ Ca2+組eNOS活性均降低(Plt;0.05)，而vehicle+精胺+Ca2+組eNOS活性無顯著差異(Pgt;0.05)，見圖3。

5不同處理因素刺激下HUVECs內(nèi)NO含量的變化

與對(duì)照組相比，精胺組NO熒光強(qiáng)度值增加；與精胺組相比，精胺+Ca2+組NO熒光強(qiáng)度值進(jìn)一步增加(Plt;0.05)， Calhex231+精胺組NO熒光強(qiáng)度值明顯降低(Plt;0.05)，filipin+精胺組及Cav-1 shRNA+精胺組細(xì)胞內(nèi)NO熒光強(qiáng)度值無顯著差異(Pgt;0.05)。與精胺+Ca2+組相比，Calhex231+精胺+Ca2+組、filipin+精胺+Ca2+組及Cav-1 shRNA+精胺+Ca2+組細(xì)胞內(nèi)NO熒光強(qiáng)度值均明顯降低(Plt;0.05)，而vehicle+精胺+Ca2+組細(xì)胞內(nèi)NO熒光強(qiáng)度值無顯著差異(Pgt;0.05)，見圖4。

Figure 3.The changes of eNOS activity in HUVECs with different treatments.±sE.n=6.*Plt;0.05 vs control group;△Plt;0.05 vs spermine group; #Plt;0.05 vs spermine+Ca2+group.

Figure 4.The changes of NO content in HUVECs after different treatments.±sE.n=6.*Plt;0.05 vs control group; △Plt;0.05 vs spermine group; #Plt;0.05 vs spermine+Ca2+group.

討 論

隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)CaR激活有影響NO生成的作用。在培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤模型中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CaR 激動(dòng)劑細(xì)胞外Ca2+濃度升高時(shí)，CaR激活上調(diào)iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)，并導(dǎo)致 NO生成增加，對(duì)nNOS和eNOS無影響,在此過程中細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i無變化[4]。Ziegelstein等[5]證實(shí)在人的主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中精胺激活CaR,經(jīng)PLC增加胞內(nèi)IP3使內(nèi)鈣釋放導(dǎo)致[Ca2+]i增加和NO生成。本研究以HUVECs為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精胺刺激下HUVECs內(nèi)eNOS的活性與NO含量增加，而CaR負(fù)性變購(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex231處理完全阻斷了精胺介導(dǎo)的上述作用，充分證明HUVECs內(nèi)精胺刺激下HUVECs內(nèi)eNOS的活性與NO含量增加由CaR介導(dǎo)。此外，Koyama等[8]研究表明外Ca2+內(nèi)流是細(xì)胞內(nèi)NO合成的先決條件 ，CaR介導(dǎo)的鈣內(nèi)流在eNOS的激活與NO生成中作用尚不清楚，故本研究亦在細(xì)胞外有鈣的情況下(作為外鈣來源，模擬CaR激活介導(dǎo)外鈣內(nèi)流)，給予精胺刺激與單純精胺刺激相比，HUVECs內(nèi)eNOS的活性與NO含量進(jìn)一步增加，Calhex231只能部分阻斷此作用，這與我們前期按照上述同樣方式處理后HUVECs[Ca2+]i變化趨勢(shì)一致(資料已整理投稿)。該結(jié)果說明精胺激活CaR后引發(fā)胞內(nèi)鈣釋放和激活的外鈣內(nèi)流共同參與了上述過程，而在細(xì)胞外有鈣的情況下進(jìn)一步加強(qiáng)了精胺介導(dǎo)的上述效應(yīng)，證實(shí)了在HUVECs中CaR激活介導(dǎo)持續(xù)Ca2+內(nèi)流亦是NO生成所必須的。我們的研究結(jié)果與上述在睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤模型中的研究結(jié)果相比提示：在不同組織細(xì)胞經(jīng)不同配體(Ca2+或精胺)激活CaR影響NO生成中的作用，激活了不同的NOS，對(duì)Ca2+依賴也有所不同。

已有研究表明CaR作用機(jī)制主要由G蛋白α亞基介導(dǎo)，但此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制作用并不能完全解釋CaR的生物學(xué)效應(yīng)，與CaR相互作用蛋白賦予CaR獨(dú)特的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特征[6]，作為eNOS負(fù)調(diào)控蛋白的Cav-1是與CaR相互作用的蛋白之一。然而，并非在所有組織細(xì)胞都存在CaR和Cav-1相互作用，即使同一種與CaR相互作用蛋白定位于不同的組織細(xì)胞其調(diào)節(jié)功能也不同,如在培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞株(Saos-2)和甲狀旁腺細(xì)胞，CaR和Cav-1形成復(fù)合物并共定位于胞膜，在Saos-2，Cav-1可上調(diào)CaR激活引起的[Ca2+]i增加[7]，而在甲狀旁腺細(xì)胞使用一種膽固醇結(jié)合劑filipin破壞Caveolae的結(jié)構(gòu)和功能，可阻斷CaR誘導(dǎo)的 ERK1/2激活[9]。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaR和Cav-1兩者共定位于HUVECs膜上，Cav-1對(duì)CaR介導(dǎo)的鈣內(nèi)流有下調(diào)作用，Cav-1對(duì)CaR介導(dǎo)的NO生成又有何種調(diào)節(jié)作用呢？結(jié)果發(fā)現(xiàn)Caveolae結(jié)構(gòu)抑制劑filipin處理后對(duì)HUVECs中Cav-1蛋白沒有影響，卻抑制了有細(xì)胞外鈣的情況下精胺激活CaR引發(fā)的eNOS活性與NO含量增加，對(duì)單獨(dú)精胺刺激介導(dǎo)的上述效應(yīng)無影響。為進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中在保證RNAi特異性抑制Cav-1前提下，觀察到與filipin處理一致的結(jié)果。該結(jié)果證實(shí)，在HUVECs，Cav-1對(duì)CaR經(jīng)外鈣內(nèi)流介導(dǎo)的eNOS激活和NO生成有促進(jìn)作用。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)Cav-1干擾后在Cav-1蛋白表達(dá)降低同時(shí)CaR膜蛋白表達(dá)也降低，CaR漿蛋白沒有變化，推測(cè)Cav-1可能充當(dāng)CaR膜定位及對(duì)激動(dòng)劑反應(yīng)實(shí)現(xiàn)各種不同功能的重要伴侶蛋白，由于filipin處理及Cav-1干擾后HUVECs的小凹結(jié)構(gòu)破壞減少了CaR蛋白在膜上定位，使CaR對(duì)激動(dòng)劑反應(yīng)降低，抑制了spermine刺激CaR介導(dǎo)的上述效應(yīng)。

通過上述一系列實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)在HUVECs中CaR有通過增加[Ca2+]i使NO生成增加的作用，此過程由CaR激活介導(dǎo)內(nèi)鈣釋放、外鈣內(nèi)流共同參與，其中，外鈣內(nèi)流對(duì)促進(jìn)釋放NO生成尤為重要，Cav-1在CaR介導(dǎo)的NO生成過程中起著促進(jìn)作用。

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Roleofcaveolin-1inextracellularCa2+-sensingreceptor-mediatedNOgenerationinhumanumbilicalveinendothelialcells

WANG Zhen-huan1,2,HU Qing-hua3,ZHONG Hua1,2,DENG Feng-mei1,2,CHEN Xiong-ying1,2,SUN Zhi-ping4,HE Fang1,2

(1KeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseases,MinistryofEducation,2DepartmentofPathophysiology,3CentreofMedicalFunctionalExperiments,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China;4DepartmentofPathophysiology,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,KeyLaboratoryofRespiratoryDiseases,HealthMinistryofChina,Wuhan430030,China.E-mail:fangf2002shz@126.com)

AIM: To study the role of caveolin-1 (Cav-1) in extracellular Ca2+-sensing receptor (CaR)-induced production of nitric oxide (NO) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSThe expression ofCav-1 gene in HUVECs was silenced by transfection of constructed Cav-1 short hairpin RNA (Cav-1 shRNA) interference plasmids.The HUVECs in second or third passage were divided into 10 groups: control group,spermine group,spermine+Ca2+group,Calhex231+spermine group,Calhex231+spermine+Ca2+group,filipin+spermine group,filipin+spermine+Ca2+group,vehicle+spermine+Ca2+group,Cav-1 shRNA+spermine group and Cav-1 shRNA+spermine+Ca2+group.The protein levels of Cav-1 and CaR in HUVECs were detected by Western blotting after transfection.The production of NO and the activity of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) were determined using the fluorescent NO indicator,3-amino-4-methylamino-2’,7’-difluorofluorescein diacetate (DAF-FM DA).RESULTSThe protein expression of Cav-1 in HUVECs was decreased after transfected withCav-1 shRNA.Simultaneously,the CaR membrane protein was decreased,whereas CaR protein level in the cytosol was unaffected.Whether in the culture medium with or without Ca2+,the CaR agonist spermine at concentration of 2 mmol/L resulted in an increase in the activity of eNOS and the production of NO in HUVECs.In the presence of spermine,the production of NO and activity of eNOS in HUVECs were abolished (without Ca2+) or decreased (with Ca2+) after inhibition of CaR by a negative allosteric modulator Calhex231 (1 μmol/L,Plt;0.05).In the presence of Ca2+,the effect of spermine on the increase in the activity of eNOS and the production of NO in HUVECs was also attenuated after acute caveolae disruption with filipin (1.5 mg/L) or transfected withCav-1 shRNA (Plt;0.05).CONCLUSIONCaR-mediated production of NO in HUVECs might be promoted by the binding of Cav-1 to CaR.The mechanism is involved in the effect of Cav-1 on the localization of CaR at the plasma membrane,thus changing the responsibility of CaR.

Caveolin-1; Human umbilical vein endothelial cells; Receptors,calcium-sensing; Nitric oxide

1000-4718(2011)05-0934-05

R364.1+4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.019

2010-08-20

2011-03-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30860099)

△通訊作者 Tel: 0993-2057151；E-mail：fangf2002shz@126.com