miR-210對血管內皮細胞VEGF-Notch信號通路的調控*

婁遠蕾， 劉 芬， 高法梁， 阮瓊芳， 崔蘇萍， 鄧志鋒△， 汪 泱△

(南昌大學1第一附屬醫院泌尿外科研究所，2第二附屬醫院神經外科，江西 南昌 330006)

miR-210對血管內皮細胞VEGF-Notch信號通路的調控*

婁遠蕾1▲， 劉 芬1▲， 高法梁2， 阮瓊芳1， 崔蘇萍1， 鄧志鋒2△， 汪 泱1△

(南昌大學1第一附屬醫院泌尿外科研究所，2第二附屬醫院神經外科，江西 南昌 330006)

目的： 觀察過表達miR-210對血管內皮細胞中血管內皮生長因子(VEGF)-Notch信號通路相關分子表達的影響，探討miR-210調控血管新生的分子機制。方法采用常規方法培養人臍靜脈內皮細胞(HUVE-12)。通過轉染LV- miR-210-GFP重組慢病毒載體上調內皮細胞miR-210表達，實驗分為miR-210過表達組(LV- miR-210-GFP)和對照組(LV-GFP)。采用real-time PCR檢測miR-210的表達變化，流式細胞術檢測ephrin-A3的表達，采用real-time PCR、Western blotting、免疫熒光細胞化學染色法分別檢測VEGF-Notch信號通路相關分子VEGF、VEGF 2(VEGFR 2)、Notch1的mRNA和蛋白表達水平。結果Real-time PCR結果顯示，與對照組相比，miR-210過表達組miR-210表達水平上調了(32.10±1.26)倍；流式細胞術結果顯示，miR-210過表達組陽性細胞率[(73.22±1.45)％]較對照組[(12.52±0.67)％]明顯增加(Plt;0.05)。Real-time PCR結果顯示，miR-210過表達組 VEGF、VEGFR2、Notch1 mRNA分別較對照組上調了(7.40±0.67)、(2.50±0.10)、(9.70±0.72)倍,Plt;0.05；免疫熒光結果顯示，miR-210過表達組VEGF和VEGFR2紅色熒光信號均顯著強于對照組(Plt;0.05)。Western blotting 結果顯示，miR-210過表達組血管內皮細胞中Notch1的蛋白表達量(4.22±0.60)較對照組明顯升高(Plt;0.05)。結論miR-210過表達可顯著上調VEGF-Notch信號通路分子的表達水平。

miR-210； 血管內皮細胞； 血管內皮生長因子； Notch1

缺血性損傷是器官衰竭的主要誘因，盡快促進血管新生、恢復有效血供是修復損傷的關鍵。血管新生受多種細胞因子的調控，主要是一些促血管生長因子，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)家族、肝細胞生長因子、血管生成素、內皮素-1、轉化生長因子-α等，其中VEGF是重要的調控因子[1-3]。研究表明，VEGF可誘導動脈內皮細胞上Notch1 的表達，參與新生血管的形成[4]。但VEGF-Notch信號通路的上游調控因子仍所知甚少。微小RNA(microRNA,miRNA)對血管新生亦有重要的調控作用。研究報道，miR-210是缺氧誘導miRNA，在缺氧條件下，miR-210在內皮細胞的表達上調，并能促進毛細血管樣結構形成及細胞遷移[5]。生物學軟件預測miR-210可調控VEGF[6]，然而miR-210對血管新生可能的調控途徑及機制尚不清楚。

為進一步探討miR-210調控血管新生的機制，本研究通過過表達血管內皮細胞miR-210，觀察VEGF-Notch信號通路相關分子的變化，以明確miR-210對VEGF-Notch信號通路的影響。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞 人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVE-12)購自長沙贏潤生物技術有限公司。

1.2主要試劑 Trizol reagent(Invitrogen)；逆轉錄試劑盒(Promega)；PE標記Ⅱ抗(Abcam)；VEGF抗體、血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)抗體、Notch1抗體、ephrin-A3抗體和羅丹明標記Ⅱ抗均購自Santa Cruz。

2方法

2.1細胞培養 以1×109/L HUVE-12細胞接種于培養瓶中，在含15％FBS的RPMI-1640培養液中置于37 ℃、5％CO2孵箱中培養，隔天換液。細胞貼壁生長呈鵝卵石樣；細胞增殖至約80％融合時，0.25％EDTA胰蛋白酶消化傳代。

2.2重組慢病毒的構建及轉染 針對目標序列，設計合適的PCR引物；將合成的2條引物，進行退火，將目標載體與引物退火產物分別進行雙酶切。將純化回收的酶切產物進行定向連接，其產物轉化細菌感受態細胞，對長出的克隆先進行PCR鑒定，其上、下游引物都設計在載體上，PCR鑒定為陽性克隆，證明目的片段已經定向連入目的載體。再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和分析比對，比對正確的即為構建成功的質粒載體。

轉染前24 h以3.0×108/L密度將內皮細胞種至6孔板。以感染復數(multiplicity of infection,MOI)為10加入0.75 μL病毒原液(終濃度為3.0×109cell/L)，每孔中加入Polybrene，終濃度為5 mg/L。轉染72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光，估算細胞轉染效率。實驗分為miR-210過表達組(LV- miR-210-GFP轉染組)與對照組(LV-GFP轉染組)。

2.3實時定量PCR法檢測miR-210及VEGF、VEGFR2、Notch1基因的表達變化 轉染72 h后收集細胞，采用Trizol法抽提總RNA，核酸測定儀測A260/A280，要求在1.8-2.0之間，同時1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量。參考文獻[7]，采用stem-loop引物進行miR-210逆轉錄，反應條件如下：16 ℃ 30 min,30 ℃,30 s,42 ℃,30 s,50 ℃,1 s,共60個循環；70 ℃ 15 min。以U6為內參照。普通基因表達檢測以GAPDH為內參照。采用SYBR Green I qPCR方法進行擴增，檢測系統為ABI 7500 real-time PCR system，反應條件如下：95℃,10 min,95 ℃,15 s,60 ℃,30 s，40個循環。最后行融解曲線分析。每個樣本設3個重復管，同時設無模板陰性對照。基因表達的相對變化以2-ΔΔCt表示。

2.4流式細胞學檢測ephrin-A3表達變化 消化細胞，調整密度為2.5×105cells/50 μL的PBS細胞懸液，加入多聚甲醛固定，加入Ⅰ抗2.5 μL，加入PE標記的Ⅱ抗1 μL，避光保存待上機檢測。

2.5免疫熒光染色法檢測VEGF和VEGFR2的表達變化 將細胞種植在蓋玻片上，約生長密度在60％取出。以1％牛血清白蛋白封閉，加Ⅰ抗(1∶100)，37 ℃孵育2 h，加Ⅱ抗(1∶200)，37 ℃下避光反應50 min，DAPI染色5 min，50％甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。每張蓋玻片選取5個不重疊的視野于同一曝光度下拍照，采用Image J軟件半定量比較兩組紅色熒光吸光度平均值。

2.6Western blotting檢測Notch1的表達變化 收集內皮細胞，按照總蛋白提取試劑盒說明提取總蛋白并進行蛋白定量。取30 μg蛋白上樣，PAGE電泳，轉至硝酸纖維素膜2 h，5％脫脂奶粉室溫封閉1 h。加Ⅰ抗(1∶1 000大鼠抗人Notch1)，37 ℃孵育2 h，TBST緩沖液洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗大鼠IgG(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，BST緩沖液洗膜，ECL試劑顯影。以β-actin蛋白作為內參照。

3統計學處理

結 果

1慢病毒轉染內皮細胞后miR-210表達水平明顯上調

重組慢病毒轉染至HUVE-12后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，GFP陽性率在80％以上。Real-time PCR 結果顯示，LV- miR-210-GFP慢病毒轉染內皮細胞后，與對照組比較，miR-210上調了(32.10±1.26)倍,Plt;0.05,見圖1。這表明LV- miR-210-GFP的重組慢病毒轉染可過表達miR-210。

2miR-210可抑制內皮細胞ephrin-A3的表達

流式細胞學結果顯示，miR-210過表達組和對照組ephrin-A3陽性細胞率分別為(12.52±0.67)％和(73.22±1.45)％，miR-210轉染后ephrin-A3陽性細胞明顯減少，Plt;0.05,見圖2。這表明miR-210的上調可抑制其靶基因ephrin-A3的蛋白表達。

Figure 1.MiR-210 overexpression in HUVE-12 cells.miR-210 expression was significantly up-regulated after LV-miR-210-GFP transfection±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV-GFP group.

Figure 2.The expression of ephrin-A3 protein after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.Flow cytometry analysis showed that ephrin-A3 protein was down-regulated compared to LV-GFP group;A:LV-GFP group;B: LV- miR-210-GFP group; C：percentage of ephrin-A3-positive cells .±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV-GFP group.

3miR-210可促進血管內皮細胞VEGF、VEGFR2、Notch1mRNA的表達

Real-time PCR 結果顯示，miR-210過表達后， VEGF、VEGFR2、Notch1較對照組分別上調了(7.40±0.67)倍、(2.50±0.10)倍、(9.70±0.72)倍,Plt;0.05,見圖3。表明miR-210可上調血管內皮細胞VEGF-Notch信號通路相關分子的mRNA表達水平。

4miR-210可促進血管內皮細胞VEGF、VEGFR2、Notch1蛋白的表達

免疫細胞化學熒光染色結果顯示，VEGF、VEGFR2陽性紅色熒光信號位于細胞胞漿和胞膜，與對照組比較，miR-210過表達組VEGF和VEGFR2紅色熒光信號均顯著增強，通過Image J軟件半定量分析，VEGF和VEGFR2熒光吸光度值明顯增加(Plt;0.05)，見圖4。Western blotting結果顯示，與對照組比較，miR-210過表達組血管內皮細胞中Notch1的蛋白表達條帶信號增強，通過Image J軟件半定量分析，miR-210過表達組蛋白表達量為4.22±0.60，對照組蛋白表達量為1，兩組比較有顯著差異(Plt;0.05),見圖5。

Figure 3.The expression of VEGF,VEGFR2 and Notch1 mRNA after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.RT-PCR showed that mRNA expression of VEGF,VEGFR2 and Notch1 was all up-regulated compared to LV-GFP group .±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV-GFP group.

Figure 4.The protein expression of VEGF and VEGFR2 after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.The result of immunofluorescence showed the protein expression of VEGF and VEGFR2 was up-regulated compared to LV+GFP group.A:VEGF (LV-GFP group);B: VEGF(LV- miR-210 -GFP group);C: VEGFR2(LV-GFP group);D: VEGFR2 (LV- miR-210 -GFP group).Bar=50um.E：VEGF and VEGFR2 protein fold change±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV+GFP group.

Figure 5.The expression of Notch1 after miR-210 overexpression in vascular endothelial cells.Western blotting showed that Notch1 was up-regulated compared to LV+GFP group±s.n=3.*Plt;0.05 vs LV+GFP group.

討 論

近年研究表明，miRNA對血管新生具有重要的調控作用[8]。眾所周知，臟器缺血可誘發反應性血管新生(angiogenesis)，即在原有血管的基礎上，內皮細胞增殖、遷移和重塑形成新血管[9]。通過促血管新生來修復缺血性損傷已成為國內外新的研究熱點。研究發現，miR-210是缺氧誘導miRNA。缺氧時，miR-210在內皮細胞中的表達上調，并促進毛細血管樣結構形成及細胞遷移，而抑制miR-210能阻斷血管新生[5]。我們的前期研究表明，腦缺血后皮質區miR-210表達穩定上調[10]；小鼠腎缺血后miR-210亦表達上調，其靶基因ephrin-A3蛋白顯著下調[11]，但miR-210對缺血/缺氧后血管新生可能的調控機制尚不清楚。故本研究通過在血管內皮細胞過表達miR-210，探討其對血管新生相關信號分子的影響。

在血管生成過程中，VEGF是最重要的調控因子。研究表明，VEGF作為Notch信號的上游調控因子，可誘導動脈內皮細胞上Notch1和DLL4(Notch配體)的表達，從而促進血管的發育[4]。miR-210能否對VEGF-Notch信號通路起調控作用，對于闡明缺血后血管新生的機制具有重要意義。

通過生物學軟件預測，miR-210可調控VEGF[6]。有研究證實miR-210可影響內皮細胞對VEGF的敏感性[5]。但miR-210對Notch信號分子的影響尚未見報道。本研究過表達血管內皮細胞的miR-210，觀察VEGF-Notch信號通路相關分子表達的變化。研究結果顯示，與對照組比較，miR-210過表達組miR-210顯著上調，其靶基因ephrin-A3的陽性細胞數明顯減少，證實LV- miR-210-GFP重組慢病毒載體可介導穩定過表達miR-210； VEGF、VEGFR2、Notch1基因及蛋白表達水平較對照組顯著上調，說明miR-210過表達可顯著上調VEGF-Notch信號通路相關分子的表達水平。提示miR-210可通過VEGF-Notch信號通路參與血管新生的調控過程，為闡明miR-210調控血管新生的分子機制提供了實驗依據。

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控制人類誘導多能干細胞多能性和決定早期細胞命運的信號通路

胚胎源性人類多能干細胞和重編程的(reprogrammed)體細胞來源的人類多能干細胞的共同特征包括無限增殖和持久、廣泛地向各種類型細胞分化的潛能。但是在維持細胞多能性和調控細胞分化方面，這兩種來源的細胞是否依賴相似的機制仍然存在爭議，而在這些機制中出現任何一點差異都將會導致經重編程的成纖維細胞產生的多能誘導干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的多能性發生異常改變。在此情況下，目前用于促使人類胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)擴增和分化的方法可能并不能直接適用于人類iPSCs的擴增和分化。歐洲科學家發現，人類iPSCs依賴activin/nodal/TGFβ信號通路，控制同源蛋白轉錄因子Nanog表達，從而維持其多能性(人類ESCs也同樣依賴該信號通路)。由此可見，人類iPSCs維持自身多能性的機制與人類ESCs的機制相似。同時，他們還證實，在人類ESCs特異地分化為胚外組織、神經外胚層及中胚層的過程中，充足的生長因子是其必要條件，而這些生長因子同樣可以促使人類iPSCs分化為以上各組織。以上實驗為了避免可能出現的干擾發育機制分析的因素，是在純粹的化學合成的培養基中進行的，而且實驗獲得的某些組織與今后臨床應用需要的并不完全相同。綜上所述，人類iPSCs維持自身多能性和調控自身分化所依賴的機制與人類ESCs的機制相似，也可以說這些不同類型的多能細胞在功能方面是等同的。

Stem Cells,2009,27(11):2655-2666(李麗娜)

RegulatoryeffectofmiR-210overexpressiononVEGF-Notchsignalingpathway

LOU Yuan-lei1,LIU Fen1,GAO Fa-liang2,RUAN Qiong-fang1,CUI Su-ping1,DENG Zhi-feng2,WANG Yang1

(1InstituteofUrology,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofNeurosurgery,TheSecondAffiliatedHospital,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:wangy63cn@sina.com)

AIM: To explore the potential mechanism of angiogenesis by investigating the regulatory effect of miR-210 overexpression on vascular endothelial growth factor(VEGF)-Notch signaling pathway.METHODSMiR-210 overexpression was induced in human umbilical vein endothelial(HUVE-12) cells by lentivirus transfection.The HUVE-12 cells were divided into 2 groups: miR-210 overexpression group (LV-miR-210-GFP) and control group (LV-GFP).The change of ephrin-A3 protein was detected by flow cytometry analysis.The mRNA and protein levels of VEGF-Notch signaling molecules,VEGF,VEGF receptor 2(VEGFR 2)and Notch 1,were determined by the methods of real-time PCR,immunofluorescence and Western blotting.RESULTSCompared to the control cells,significant down-regulation of ephrin-A3 protein was observed in HUVE-12 cells with miR-210 overexpression,while both mRNA and protein levels of VEGF,VEGFR2 and Notch1 were up-regulated.CONCLUSIONmiR-210 may be involved in VEGF-Notch signaling pathway to regulate angiogenesis.

miR-210; Vascular endothelial cells; Vascular endothelial growth factors; Notch1

1000-4718(2011)05-0923-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.017

2010-11-24

2011-03-09

國家自然科學基金資助項目(No.30960396；No.81060059)

△通訊作者 鄧志鋒 Tel：0791-6282662;E-mail:dengzf@126.com； 汪泱 Tel:0791-8692527；E-mail:wangy63cn@sina.com

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