白細胞介素-27對白血病細胞株U937細胞生物學行為的影響

郭小燕， 翟鳳范蕊芳， 林東軍△

(中山大學 1附屬第三醫院血液科，2血液病研究所，廣東 廣州 510630)

白細胞介素-27對白血病細胞株U937細胞生物學行為的影響

(中山大學1附屬第三醫院血液科，2血液病研究所，廣東 廣州 510630)

目的： 探討白細胞介素-27(IL-27)對人單核細胞白血病細胞株U937細胞的影響及其機制。方法用不同劑量的重組人IL-27和U937細胞分別共培養24 h和48 h，用熒光定量PCR測定細胞中促凋亡基因p53、bax及caspase-3、主要組織相容性復合物Ⅰ(MHCⅠ)類分子、協同刺激分子CD86和黏附分子CD54的表達，流式細胞儀檢測U937細胞表面CD86和CD54的表達，并用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定IL-27對細胞增殖的影響。結果PCR結果顯示經過不同劑量IL-27刺激后，U937細胞中促凋亡基因p53和bax表達增加，同時，U937細胞中凋亡相關蛋白caspase-3的表達及活性也有相應增加；MTT結果顯示，IL-27可以抑制U937細胞增殖并和抗腫瘤藥物阿糖胞苷產生協同作用；IL-27可以誘導U937細胞中的MHCⅠ類分子(HLA-A,B,C)、表面的協同刺激分子CD86和黏附分子CD54的表達增加。結論IL-27可以誘導U937細胞中促凋亡基因的表達，直接抑制細胞增殖,對細胞中MHCⅠ、CD86和CD54的表達有誘導作用。這可能是IL-27抗腫瘤作用的重要機制。

白細胞介素27; U937細胞; 白血病; 單核細胞

白細胞介素-27(interleukin-27，IL-27)是新發現的IL-12家族細胞因子， 由EBI3(EBV-induced gene 3)和P28表達產物組成的異二聚體，其受體也是由2個亞基IL-27Ra(又名WSX-1或T-CCR)和gp130構成，共同表達于很多免疫細胞，如：CD4+T/CD8+T、B細胞、NK細胞、單核細胞、樹突狀細胞等[1]。IL-27在機體的免疫調節中起到重要作用，它可以影響T細胞的分化，誘導T細胞向Th1方向分化，促使Th1型細胞因子表達，同時抑制Th2和Th17分化，并協同IL-12刺激細胞產生IFN-γ。在Th1高度活化時，IL-27卻可以限制Th1型應答的強度。由于IL-27具有促進Th1型反應和減輕炎癥的雙重作用，它可能是多種主要以Th1型反應為主的病理過程(如感染免疫、自身免疫病和抗腫瘤免疫)的關鍵性調節因子[1-4]，但是作為IL-12家族的成員，除了免疫調節作用之外，學者們更關注其抗腫瘤活性，2004年，Hisada等[5]首次證實了IL-27的抗腫瘤活性。他們將穩定表達IL-27的小鼠結腸癌細胞C26移植到小鼠體內，發現腫瘤生長大大受抑，主要由CD8+T細胞、IFN-γ和T-bet介導其抗腫瘤作用。Yuan等[6]在BM-NSCs(骨髓來源的神經干細胞樣細胞)中導入單鏈IL-27 cDNA，再將其注入小鼠顱內GL-26 神經膠質瘤，有50％小鼠幸存，且幸存的小鼠對顱內再次注射同種瘤細胞株有了持久的免疫力，表明機體產生了對腫瘤細胞的免疫記憶。Salcedo等[7]進一步證實，IL-27可以顯著增加CD8+T細胞的局部浸潤能力和局部IFN-γ基因的表達，并可以顯著上調腫瘤細胞表面的主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ類分子的表達，增加腫瘤細胞對機體的腫瘤特異性細胞素性T細胞(cytotoxic T-lymphocyte,CTL)的敏感性。但是大多數的實驗都是局限在實體瘤模型中，Feng等[8]證實，IL-27可以誘導人單核細胞白血病細胞株THP-1細胞表面的MHC分子、協同刺激分子CD86、CD80和黏附分子CD54的表達，并能誘導THP-1細胞分泌IFN-γ。我們的前期實驗(結果未發表)證實IL-27受體的2個亞基在急性單核細胞白血病患者細胞中高表達，而且IL-27可以直接誘導人單核細胞白血病細胞株U937細胞的凋亡，并呈現出一種劑量依賴關系。本實驗旨在探討IL-27是否可以誘導U937細胞MHCⅠ類分子、黏附分子CD54及協同刺激分子CD86的表達，是否誘導U937細胞促凋亡基因p53及bax的表達，并激活凋亡相關蛋白caspase-3，以及IL-27是否跟抗腫瘤藥物阿糖胞苷(arabinosylcytosine,Ara-C)發揮協同作用。

材 料 和 方 法

1材料

U937細胞株由上海細胞庫提供；重組人IL-27、重組人IFN-γ(eBioscience)購于廣州康潤生物有限公司；PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa DRR037A)、SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa DRR041A)購于廣州潤真生物有限公司;CD86 PE和CD54 PE(eBioscience)購于廣州康潤生物有限公司;Taq酶(天根生化科技)購于廣州合達生物科技有限公司；caspase-3活性試劑盒(碧云天生物科技)；MTT檢測試劑盒(碧云天生物科技)；引物序列由廣州英韋創津生物科技有限公司合成。

2方法

2.1細胞培養 U937細胞在10％小牛血清的RPMI-1640培養基中，于37 ℃、5％CO2的培養箱中培養，2-3 d傳代1次。然后取對數生長期細胞進行實驗。

2.2PCR及熒光定量PCR 測定MHCⅠ類分子(HLA-A,B,C)、p53、bax、caspase-3、CD86，CD54的表達 取對數生長期的細胞，以2×108cells/L接種至6孔板，加入不同濃度的IL-27(0、20、40、60 μg /L),共同培養24 h，48 h。Trizol法提取總RNA，并逆轉錄成cDNA，以紫外分光光度計測RNA的含量和純度(RNA在260 nm和280 nm的吸光度比值為1.8-2.0之間)。以1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性(28S和18S RNA條帶比值gt;2.0)。應用Omiga 20軟件設計MHCⅠ類分子(HLA-A,B,C)、p53、bax、caspase-3、CD86、CD54的引物序列。CD54正義鏈5’- TCACGGAGCTCCCAGTCCTAA -3’,反義鏈 5’-AAAGGCAGGTTGGCCAATGA-3’；CD86正義鏈 5’- TGGCCTAGGGTACAGGCAACA -3’,反義鏈 5’-GCCCAGATAGAAGTGGCTCCAG-3’；p53正義鏈 5’-AGAGCTGAATGAGGCCTTGGAA-3’,反義鏈 5’- GAGTCAGGCCCTTCTGTCTTGAAC -3’；bax正義鏈 5’-CATCATGGGCTGGACATTGG -3’,反義鏈 5’-CCACAAAGATGGTCACGGTCTG-3’；caspase-3正義鏈 5’- GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3’,反義鏈 5’-CTGAGGTTTGCTGCATCGACA-3’；HLA-A正義鏈 5’-GACGACACGCAGTTCGTGC-3’,反義鏈 5’- CATGTCCGCCGCGGTCCAA -3’；HLA-B正義鏈 5’- ACCAGAGCGAGGCCGGG -3’,反義鏈 5’- GTGTCCGCSCGGTCCAG-3’；HLA-C正義鏈 5’- CGCGCGGAGTCCRAGAGG-3’,反義鏈 5’-GTGTCCGCSCGGTCCAG-3’；β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)正義鏈 5’-CTCGCGC TACTCTCTCTTTCTGG-3’,反義鏈 5’- GCTTACATGTCTCGATCCCACTTAA-3’；GAPDH正義鏈5’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,反義鏈 5’- TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；按照TaKaRa試劑盒給定條件，用熒光定量PCR儀進行基因擴增。

2.3Caspase-3活性的測定 按照caspase-3活性試劑盒說明進行操作。首先制作對硝基苯胺(p-nitroaniline,pNA)標準曲線；然后收集培養了24 h的U937細胞后600 r/min 4 ℃ 離心5 min；棄上清，加入1mL PBS，900 r/min 4 ℃ 離心5 min;棄上清，加入200 μL裂解液，冰浴15 min;4 ℃ 23 500 r/min離心15 min;取上清120 μL于預冷離心管。在96孔板中加樣，每孔加入Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Aspp-nitroaniline)10 μL，待測樣本10 μL，加檢測緩沖液補足100 μL，每個樣本設置3個復孔，并設置空白對照。37 ℃孵育4 h后,測在405 nm處的吸光值(A405)。Caspase-3活性表示為實驗組與對照組的相對值，對照組caspase-3的活性默認為1。

2.4MTT檢測細胞增殖 將100 mL 2×108cells/L細胞種入96孔板中，培養24 h，然后加不同的處理因素刺激細胞，空白組只加培養基，對照組不加處理因素，每組設5個復孔，繼續培養。培養24 h后每孔加入10 μL MTT溶液，繼續孵育4 h，然后每孔加入100 μL formazan溶解液，在細胞培養箱內繼續孵育，直至在普通光學顯微鏡下發現formazan全部溶解，在570 nm測定吸光度。生長抑制率=(1-A實驗組/A對照組)×100％。

2.5流式細胞術檢測細胞表面CD86和CD54的表達 將2×108cells/L的細胞懸液100 mL接種于6孔板中，培養24 h，然后加入40 μg/L IL-27刺激細胞，以50 μg/L IFN-γ作為陽性對照，繼續培養48 h后收集細胞，2 000 r/min離心10 min，加入2 mL PBS，洗滌2次，然后加入100 mL PBS重懸細胞，加入20 μL PE標記的抗CD86抗體或抗CD54抗體室溫共同孵育30 min，加入PBS 2 mL，洗滌1次，加入200 mL PBS重懸細胞，用流式細胞儀測定。以上實驗重復3次。

3統計學處理

結 果

1IL-27誘導U937細胞中促凋亡基因的表達增加

結果見圖1：IL-27 可以誘導U937細胞中p53及bax mRNA的表達，呈現出劑量相關性，在IL-27濃度為40 μg/L時，IL-27的誘導作用最強。

Figure 1.Effect of IL-27 on expression of p53 and bax mRNA in U937 cells.The mRNA level of each sample were normalized to the level of GAPDH±s.n=9.*Plt;0.05 vs 0 μg/L group.

2IL-27對U937細胞中caspase-3表達的影響

IL-27可以明顯增加U937細胞中caspase-3的活性(Plt;0.05)，并且與caspase-3 mRNA水平的增加表現出一致性,見圖2。

Figure 2.Effect of IL-27 on caspase-3 mRNA expression(A) and caspase-3 activity(B) in U937 cells±s.n=3.*Plt;0.05 vs 0 μg/L group.

3IL-27對U937細胞的增殖抑制作用

將U937細胞分別和不同劑量的IL-27(0、20、40、60 μg/L)和Ara-C(5 g/L)共同孵育12 h、24 h、48 h,發現IL-27對U937細胞的增殖抑制作用隨著時間的增加而增強，見圖3A。然后將U937細胞分別與IL-27(40 μg/L),Ara-c(5 g/L)、IL-27(40 μg/L)+ Ara-c(5g/L)共同培養12 h、24 h、48 h，結果顯示，IL-27可以直接抑制U937細胞增殖(以Ara-C作為陽性對照)，IL-27還能和Ara-C產生協同效應。

4IL-27誘導U937細胞MHCⅠ類分子、細胞表面的協同刺激分子和黏附分子表達增加

使用熒光定量PCR法檢測U937細胞中MHCⅠ類分子以及協同刺激分子和黏附分子的表達(以IFN-γ作為陽性對照)。發現經過IL-27刺激之后，U937細胞中MHCⅠ類分子(HLA-A,B,C)及β2-MG表達增加,見圖4A。在U937細胞中協同刺激分子CD86和黏附分子CD54的表達呈現出相同趨勢,見圖4B。40 μg/L IL-27刺激48 h后，U937細胞表面(以IFN-γ作為陽性對照)CD86表達增加1.5倍，CD54表達增加 3倍,見圖4。

Figure 3.The antiproliferative activity of IL-27 alone(A) and combined with arabinosylcytosine (Ara-C,B) on U937 cells.±s.n=9.*Plt;0.05 vs control(0 μg/L or 0 h).

Figure 4.IL-27 increased expression of classⅠMHC mRNA and constimulatory molecules in U937 cells.A and B:expression of class Ⅰ MHC and constimulatory molecule were evaluated by real-time PCR after 24 h of stimulation with various of amounts of IL-27(0,20,40 and 60 μg/L) and IFN-γ (0,5 and 50 μg/L).C:surface expression of CD86 and CD54,as detected by flow cytometry,is shown after 48 h of incubation with medium alone,40 μg/L IL-27 or 50 μg/L IFN-γ.IFN-γ was used as a positive control in A,B and C±s.n=3.*Plt;0.05 vs control(0).

討 論

近年來腫瘤生物治療(biotherapy)已成為腫瘤治療的一種新趨勢，主要通過調動宿主的天然防御機制或給予天然(或基因工程)產生的靶向性很強的藥物來獲得抗腫瘤效應,包括腫瘤的免疫治療和基因治療，其理想機制一是誘導腫瘤細胞自身生長的停滯或凋亡；二是誘導機體內具有抗腫瘤特異性和細胞毒性的 T淋巴細胞產生，達到特異性攻擊腫瘤的作用，不僅能提高宿主免疫功能，特異性殺傷腫瘤細胞，而且對正常組織有較少的毒副作用，受到了人們的關注。由于血液腫瘤與免疫學關系密切，近年來免疫治療顯示出良好的應用前景。

細胞因子(cytokine)是由多種免疫細胞分泌的具有調節細胞生長分化、調節機體免疫功能、參與炎癥反應等功能的小分子多肽的統稱。在天然及獲得性免疫應答過程中,細胞因子表現出重要功能，重組細胞因子已成為生物應答調節劑(biological response modifier,BRM)中一類重要的治療制劑，目前IL-2及IL-11等細胞因子的基因工程產品已獲準生產并用于疾病的治療，一些細胞因子(如IL-2、IL-12、IFN、TNF)應用于抗腫瘤治療，已取得了一定的效果。

在腫瘤免疫中，細胞因子起到重要作用，IL-12就是一個很重要的腫瘤免疫因子，它誘導Th1細胞、CTL及NK細胞產生IFN-γ進而發揮抗腫瘤作用[5]。IL-27作為一種新發現的IL-12家族細胞因子，其抗腫瘤作用也是學者們關注的焦點，IL-27的強大抗腫瘤作用已經在多種實體瘤的動物實驗模型中得到證實，經過IL-27刺激的腫瘤細胞在實驗動物中形成的腫瘤體積明顯較小，并且接種過表達IL-27腫瘤細胞的實驗動物，對再次接種腫瘤細胞產生了免疫耐受；在這些動物中，學者們發現CD8+T細胞的數量增加，并且在腫瘤周圍集聚，IFN-γ的表達量也明顯增加，因此有學者提出，IL-27的抗腫瘤作用主要是依賴于有特異性殺傷作用的CD8+T細胞(CTL)和體內其它細胞產生的IFN-γ；也有學者提出，在低抗原性的腫瘤模型中IL-27的抗腫瘤活性是通過NK細胞實現的[9]；另外，IL-27可以誘導抗血管生成細胞因子表達而抑制血管的生成，產生抗腫瘤作用[10]；IL-27還可以誘導腫瘤細胞表面MHCⅠ類分子的表達，增加腫瘤細胞的抗原性及對特異性抗CTL的敏感性[9]。除此之外，IL-27對腫瘤細胞有直接增殖抑制作用也得到了證實。

本實驗中，我們首次報道了IL-27可以誘導U937細胞中表達p53和bax mRNA表達增多，這種促凋亡基因的表達增加跟IL-27的劑量有關。這種凋亡基因的表達是否引起凋亡信號通路的激活呢？我們通過測定caspase-3 mRNA水平及其蛋白活性的改變來證實凋亡信號的激活。Caspase-3是細胞凋亡信號通路中的重要下游信號分子,其活性與細胞凋亡的發生有著極密切的關系[11,12]。我們發現經過IL-27刺激之后，caspase-3的活性有增加，并且和細胞的增殖抑制呈現一致性。我們推測IL-27誘導了的細胞中促凋亡基因的表達，啟動凋亡信號，誘導凋亡相關蛋白caspase-3表達并活化，進而引起細胞凋亡。為了進一步證實IL-27的生物學作用，我們把IL-27和抗腫瘤藥物Ara-C共同作用于U937細胞，測定細胞的增殖抑制率，發現IL-27除了可以直接抑制U937細胞的增殖，還可以和阿糖胞苷產生協同作用，這可能與IL-27誘導了U937細胞中的凋亡促進蛋白表達增加有關。

腫瘤細胞是一群失去正常調控機制發生惡變的自身細胞，機體自身的免疫機制可以對這種惡變細胞進行免疫防御。腫瘤特異性CTL對腫瘤的殺傷作用是機體腫瘤免疫的一個重要環節。CTL特異性殺傷腫瘤細胞，需要協同刺激分子CD86(CD80)和協同刺激分子CD54的輔助，來識別腫瘤細胞表面由MHCⅠ類分子提呈的腫瘤特異性抗原，但是由于腫瘤細胞表面MHCⅠ類分子的表達較低，導致腫瘤細胞的抗原性低，不能被特異性識別，這是腫瘤免疫逃逸的一個重要機制[13]。在本實驗中，我們測定了U937細胞表面的的協同刺激分子CD86和黏附分子CD54，以及細胞中MHCⅠ類分子的表達，發現CD86和CD54在基因水平和蛋白水平的表達都有增加，這與之前學者的研究一致[13]。這種細胞表面MHCⅠ類分子及黏附分子、協同刺激分子的表達增加，增加了CTL對腫瘤細胞的敏感性，從而發生依賴CTL的特異性腫瘤殺傷作用，達到抗腫瘤作用。但是我們發現，在IL-27濃度為40 μg/L時，其誘導細胞表達協同刺激分子和黏附分子的作用達到最大，在MHCⅠ類分子發現了同樣的趨勢，這與之前IL-27誘導協同刺激分子表達與劑量呈正相關不同[13]，可能跟IL-27復雜的生物學作用有關。

總之，我們的實驗研究證明，IL-27有強大的抗腫瘤作用，它可以誘導U937細胞中促凋亡基因p53、bax表達增加,啟動凋亡信號通路，誘導細胞中caspase-3表達，并活化caspase-3，直接誘導細胞凋亡。除了直接誘導U937細胞的凋亡，IL-27還可以跟抗腫瘤藥Ara-C產生協同增殖抑制作用。另外，IL-27可以誘導U937細胞中的MHCⅠ類分子(HLA-A,B，C)、協同刺激分子CD86和黏附分子CD54的表達增加。

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EffectsofIL-27onacutemonocyticleukemiccelllineU937

(1DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,2InstituteofHematology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:lindongjun0168@163.com)

AIM: To investigate the effects of interleukin-27 (IL-27) on the U937 cell line of human acute monocytic leukemia and to explore the underlying mechanism.METHODSU937 cells were incubated with different concentrations of IL-27.Total RNA was isolated by Trizol.The expression levels of protein 53 (p53),Bcl-2 associated X protein (Bax),caspase-3,histocompatibility locus antigen-A (HLA-A),histocompatibility locus antigen-B (HLA-B),histocompatibility locus antigen-C (HLA-C),cluster of differentiation 86 (CD86) and cluster of differentiation 54 (CD54) were tested by real-time PCR.The expression of CD86 and CD54 on the cell surface was detected by flow cytometry.MTT method was used to determine the antiproliferative activity of IL-27.RESULTSThe results suggested that U937 cell growth was significantly inhibited by IL-27 in a dose-dependent manner.IL-27 induced the expression of pro-apoptotic genes,such asp53 andbax.The expression and activity of caspase-3 were also increased.IL-27 had antiproliferative activity and had an additive effect with arabinosylcytosine.After incubated with IL-27,high expression of class I major histocompatibility complex (MHC)，CD86 and CD54 in U937 cells were induced.CONCLUSIONIL-27 induces the expression of pro-apoptotic genesp53 andbax,which may play the antiprolifetative functions directly in U937 cells.IL-27 also induces the expression of class I MHC,CD86 and CD54,indicating an important antitumor role of IL-27.

Interleukin-27; U937cells; Leukemia; Monocytes

1000-4718(2011)05-0869-06

R557+2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.008

2010-03-10

2011-03-17

廣東省科技計劃資助項目(No.2009B080701008)

△通訊作者Tel：020-85252389;E-mail: lindongjun0168@163.com