缺氧誘導上皮性卵巢癌細胞分化逆轉機制的實驗研究*

陳 默， 殷嘯俊， 堯良清△， 李 娜， 竺鵬飛， 徐叢劍

(1復旦大學附屬婦產科醫院婦科，上海 200001；2昆山市第二人民醫院婦科，江蘇 昆山 215300)

缺氧誘導上皮性卵巢癌細胞分化逆轉機制的實驗研究*

陳 默1， 殷嘯俊2， 堯良清1△， 李 娜1， 竺鵬飛1， 徐叢劍1

(1復旦大學附屬婦產科醫院婦科，上海 200001；2昆山市第二人民醫院婦科，江蘇 昆山 215300)

目的： 在三維培養系統中進行缺氧刺激，可誘導卵巢惡性上皮性腫瘤細胞SKOV-3和ES-2向血管內皮樣細胞分化逆轉，本文擬探討其相關的分子機制。方法建立Matrigel三維培養系統，在1％O2缺氧條件下，誘導卵巢上皮性癌細胞SKOV-3和ES-2向血管內皮樣細胞分化逆轉后，應用端粒重復序列擴增法(TRAP)和實時熒光定量RT-PCR檢測原始腫瘤細胞、腫瘤內皮樣細胞和人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)端粒酶活性以及周期蛋白cyclinD1、抑癌基因p53、原癌基因v-src轉錄水平的差異。結果常氧時，SKOV-3和ES-2細胞端粒酶活性表達為陽性，缺氧誘導后SKOV-3內皮樣細胞端粒酶活性為陽性，而ES-2內皮樣細胞端粒酶活性轉為陰性。缺氧誘導后的SKOV-3和ES-2內皮樣細胞cyclinD1 mRNA的表達顯著低于常氧時SKOV-3和ES-2的表達(Plt;0.05或Plt;0.01)；和HUVECs的表達無顯著差異。SKOV-3和ES-2內皮樣細胞p53 mRNA的表達顯著高于常氧時SKOV-3、ES-2和HUVECs的表達(Plt;0.05或Plt;0.01)。缺氧和常氧狀態下各種細胞均不表達v-src mRNA。結論缺氧可以誘導少量卵巢上皮性癌細胞SKOV-3和ES-2向血管內皮樣細胞分化逆轉，主要是通過改變端粒酶的活性，調節cyclinD1和p53的轉錄水平發揮調控作用。

卵巢腫瘤； 缺氧； 血管內皮樣細胞； 細胞分化； 端粒酶； 細胞周期蛋白D1； 基因,p53； 基因,v-src

卵巢癌(ovarian carcinoma)在女性生殖道癌腫中死亡率居首位，本課題組在前期研究中發現，缺氧刺激能夠誘導少量上皮性卵巢癌細胞逆轉分化為血管內皮樣細胞，同時增加其增殖、侵襲、轉移特性，在卵巢癌的發生發展中具有重要作用[1,2]。由于血管內皮細胞為非惡性腫瘤細胞，因此本文擬研究缺氧誘導部分卵巢癌細胞逆轉分化前后細胞與正常內皮細胞在癌基因、原癌基因、周期蛋白及端粒酶的表達差異，以期探討缺氧刺激上皮性卵巢惡性腫瘤細胞分化逆轉的實質及其分子機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞來源及培養 卵巢上皮性癌細胞系SKOV-3(No.HTB-77，腺癌來源)和ES-2(No.CRL-1978，透明細胞癌來源)均購自美國標準菌庫(American Type Culture Collection，ATCC)。根據ATCC指引，用Mccoy’s 5A培養、傳代。人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)經醫院醫學倫理委員會同意，來自本院產科健康產婦足月剖宮產或順產的新生兒臍帶，長度gt;30 cm，無菌條件下沖洗血跡，臍靜脈管腔內注入0.25％胰酶+EDTA消化細胞，1 000 r/min離心10 min分離獲得消化液轉移至無菌培養皿中送細胞培養室，完全培養基(M199+10％胎牛血清)37 ℃、5％CO2培養箱培養。24 h后換液，以后每2-3 d半量換液1次，觀察細胞生長情況，可見鋪路石樣細胞。傳代至第3代時進行下一步實驗。

1.2主要試劑及儀器設備 胎牛血清購自Hyclone，Mccoy’s 5A購自Gibco，Matrigel膠購自Bamp;D；TRAP-Hyb kit端粒酶活性檢測試劑盒購自華美生物工程公司；2.5 L缺氧盒購自Mitsubishi；細胞周期分析軟件Mob Forltnacv 1.01(Bamp;D)；Rotor-Gene3000 實時PCR儀(Corbett Research)；Primer Premier 5.0軟件(Premier Biosoft)。

2方法

2.1Matrigel三維培養及缺氧誘導 Matrigel三維培養將Matrigel與含15％FBS 的Mccoy’s 5A 培養基按1∶1(V/V)混合，滴入培養板中，37 ℃孵育凝膠；分別將對數生長期SKOV-3和ES-2消化成單細胞懸液，接種在Matrigel培養系統；分別在常氧(O2濃度為21％)、缺氧(O2濃度為1％)等條件下每隔48 h更換上述培養液1次，培養7 d。將細胞培養板置于缺氧盒中，1％O2模擬缺氧環境。

2.2體外誘導形成腫瘤內皮樣細胞的鑒定 采用免疫組織化學熒光雙重標記腫瘤內皮樣細胞特異性抗原，透射電鏡下觀察腫瘤內皮樣細胞超微結構，檢測相關細胞acLDL吞噬功能等方法對SKOV-3細胞及ES-2細胞在缺氧誘導條件下轉化為內皮樣細胞及原代培養獲得的人臍靜脈內皮細胞進行鑒定。具體方法見本課題組前期實驗結果[1]。

2.3卵巢癌內皮樣細胞及相關細胞端粒酶活性的檢測 收集實驗2.1各組細胞及常氧下原代培養獲得的人臍靜脈內皮細胞，按端粒酶活性試劑盒說明書逐步操作。結果判斷：酶標儀上讀取450 nm的吸光度值(A值)。其中陽性對照為人胚腎轉化細胞系293細胞，陰性對照為65 ℃處理30 min的293細胞獲得。陰性對照A值低于0.05按0.05計算，高于0.05按實際A值計算。若A值大于0.3，則判斷為無效，需重做實驗。樣本A值大于陰性對照A值的2.1倍時，判為端粒酶活性陽性。

2.4實時定量RT-PCR檢測抑癌基因p53、原癌基因v-src和周期蛋白cyclin D1的表達 (1)引物的設計：應用Primer Premier 5.10軟件設計，掃描人類基因庫中未發現的其它同源序列。Cyclin D1:上游引物5’-GATGCCAACCTCCTCAACGAC-3’,下游引物5’- CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC-3’,產物片段為171 bp;p53:上游引物5’-GCTGCTCAGATAGCGATGGTC-3’，下游引物5’-CTCCCAGGACAGGCACAAACA-3’，產物片段為298 bp；v-src：上游引物5’-CACTCGCTCAGCACAGGACAG-3’，下游引物5’-AGAGGCAGTAGGCACCTTTCG-3’，產物片段為196 bp；β肌動蛋白(β-actin):上游引物5’-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3’，下游引物5’-GAGACCTTCAACACCCC-3’，產物片段為230 bp。(2)RNA含量及純度測定：收集實驗2.1各組細胞及常氧下原代培養獲得的人臍靜脈內皮細胞，分別提取總RNA，測定RNA含量及純度。(3)RT反應：20 μL反應體系，按照RT試劑盒操作步驟進行，合成cDNA。(4)PCR反應：20 μL反應體系，95 ℃預變性3 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環；72 ℃充分延伸7 min,結束溫度為4 ℃。(5)結果與計算：各樣品的目的基因和管家基因分別進行real-time PCR反應。根據繪制的梯度稀釋DNA標準曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結果直接由機器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

3統計學處理

結 果

1卵巢癌內皮樣細胞及相關細胞端粒酶活性的表達

常氧時SKOV-3和ES-2細胞端粒酶活性表達為陽性，缺氧誘導后SKOV-3內皮樣細胞端粒酶活性為陽性，而ES-2內皮樣細胞轉為與人臍靜脈細胞相似，端粒酶活性為陰性，見表1、2。

表1 SKOV-3及其內皮樣細胞端粒酶活性的檢測

表2 ES-2及其內皮樣細胞端粒酶活性的檢測

2體外誘導形成腫瘤內皮樣細胞的鑒定

本課題組前期實驗結果已表明[1]：缺氧可以誘導卵巢癌細胞SKOV-3和ES-2轉化為內皮樣細胞，并形成腔樣、管狀、分支和網絡狀等擬態血管。SKOV-3內皮樣細胞可表達Flk-1、AC133和vWF；細胞出現空泡樣變，表面出現微絨毛樣突起，極少數細胞出現質膜包裹的顆粒。ES-2內皮樣細胞可以表達Flk-1和CD34；細胞出現空泡樣變，表面出現微絨毛樣突起，極少數細胞出現質膜包裹的顆粒；部分細胞局部胞漿出現Dil陽性細胞，具有吞噬acLDL功能。HUVECs的鑒定：vWF表達陽性，具有acLDL吞噬功能，胞內含Weibel-Palade小體。

3卵巢癌內皮樣細胞及相關細胞cyclinD1、p53和v-srcmRNA的表達

缺氧誘導后SKOV-3內皮樣細胞cyclin D1 mRNA的表達顯著低于常氧時的表達(Plt;0.01)；與HUVECs表達比較無顯著差異(Pgt;0.05)；p53 mRNA表達顯著高于常氧時的表達(Plt;0.01)，也顯著高于HUVECs的表達(Plt;0.01)；v-src mRNA的表達與常氧和HUVECs比較均無顯著差別(Pgt;0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of cyclin D1，p53 and v-src mRNA in SKOV-3 and SKOV-3 endothelial -like cells.Analysis of real-time RT-PCR at the 7th day revealed that hypoxia decreased the mRNA expression of cyclin D1 and increased the expression of p53 in SKOV-3 cells.No significant difference of v-src mRNA expression was observed under all conditions.±s.n=3.**Plt;0.01 vs SKOV-3 in normoxia.

缺氧誘導后ES-2內皮樣細胞cyclin D1 mRNA的表達顯著低于常氧時的表達(Plt;0.05)；與HUVECs表達比較無顯著差異(Pgt;0.05)；p53 mRNA表達顯著高于常氧時的表達(Plt;0.01)，并顯著高于HUVECs表達(Plt;0.01)；v-src mRNA的表達與常氧和HUVECs比較均無顯著差別(Pgt;0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of cyclin D1，p53 and v-src mRNA in ES-2 and ES-2 endothelials-like cells.Analysis of real-time RT-PCR at the 7th day revealed that hypoxia significantly decreased the mRNA expression of cyclin D1 and increased the expression of p53 in ES-2 cells.No significant difference of v-src mRNA expression was observed under all conditions±s.n=3.**Plt;0.01 vs ES-2 in normoxia.

討 論

局部氧分壓降低是幾乎所有實體腫瘤的特征，腫瘤細胞團增至1 mm×1 mm×1 mm或更大時，中央缺氧，此時腫瘤對微環境缺氧存在自身調節和適應[3]。本課題組前期實驗中，證實缺氧可影響SKOV-3和ES-2細胞增殖、細胞周期分布、凋亡及侵襲等生物學行為[2]。同時證明，缺氧可以將卵巢上皮性癌細胞SKOV-3和ES-2誘導分化為血管內皮樣細胞，形成擬態血管，為腫瘤提供血供；惡性程度越高的腫瘤，形成擬態血管能力越強[1-3]。由于血管內皮細胞為非惡性腫瘤細胞，本文研究缺氧誘導部分卵巢癌細胞逆轉分化前后細胞與正常血管內皮細胞在端粒酶、周期蛋白、癌基因及原癌基因的表達差異。

端粒酶的表達對于維持干細胞自我更新能力和復制潛能有重要意義；端粒的長度，使得腫瘤細胞不斷增殖，以致永生化[4-7]。本文結果表明，SKOV-3在缺氧前后端粒酶活性表達均為陽性，端粒酶活性沒有發生改變，此時SKOV-3內皮樣細胞仍未完全分化為終末細胞，我們推測其可能還具有腫瘤干細胞(tumor stem cell,TSC)屬性，有可能被進一步誘導[8]。ES-2在缺氧前端粒酶活性陽性，缺氧后ES-2內皮樣細胞的端粒酶活性轉為陰性，表明 ES-2內皮樣細胞已喪失腫瘤細胞的增殖特性，同時也喪失了TSC的復制潛能，ES-2內皮樣細胞已轉化為具有特定功能與標記的終末細胞。

干細胞的特性是不斷地增殖與分化，而其進行增殖分化的前提是進入細胞周期。干細胞周期調控與其它哺乳動物細胞一樣，也是通過各種細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶等相互作用來完成的。Cyclin D1合成是細胞接受外界信號刺激而進入細胞周期的最早期事件，它推動細胞進入S期，使細胞周期進入不依賴細胞外信號刺激的不可逆階段[9-12]。本研究結果表明，缺氧后SKOV-3內皮樣細胞和ES-2內皮樣細胞cyclin D1表達顯著下降，和HUVECs無顯著差異。由此我們可以推論：缺氧誘導后的腫瘤細胞SKOV-3和ES-2受cyclin D1的調控減少，從而停滯在G期而增殖分化受阻，使其惡性程度降低。表明cyclin D1在調控卵巢癌細胞向內皮樣細胞分化中具有重要的作用。

在腫瘤發生過程中，抑癌基因p53功能喪失是目前最常檢測到的變化之一，其中卵巢癌中的突變率高達30％-79％。缺氧誘導因子-1能對野生型P53蛋白的降解起抑制作用，穩定P53使之水平升高，而對突變型P53無作用[13-16]。本研究結果表明，野生型p53在SKOV-3和ES-2細胞中表達極弱或喪失；經缺氧誘導后，在SKOV-3和ES-2內皮樣細胞表達水平顯著升高，也顯著高于HUVECs表達。本結果提示，從抑癌基因p53表達的角度來看，缺氧通過上調抑癌基因p53的表達來使SKOV-3和ES-2原有的惡性腫瘤細胞屬性降低或喪失。

v-src基因是一個促進細胞分化并參與其調節的癌基因[17]，本研究結果顯示，無論是缺氧前或后，SKOV-3和ES-2，或者它們的內皮樣細胞均不能檢測到v-src mRNA表達，提示v-src癌基因沒有參與卵巢癌細胞SKOV-3或ES-2的發生與發展，沒有參與缺氧誘導出現SKOV-3和ES-2內皮樣細胞形成的過程。

缺氧是卵巢上皮性癌血管生成擬態的主要誘導因素之一。在缺氧狀態下，正常內皮細胞增殖抑制，無法為腫瘤生長提供足夠血供。而此時卵巢癌細胞干細胞潛能優先向血管內皮細胞發展，以滿足其惡性發展的需要。根據本研究，我們推測：卵巢癌細胞向血管內皮樣細胞分化表面上看其發生逆分化，惡性程度降低；但是從長遠的發展，腫瘤血管的生成為腫瘤的生長提供了養分和轉移的途徑，增加了其危害性，因此，缺氧對上皮性卵巢癌生長發展具有雙刃劍的作用。如何阻斷其逆分化，針對逆分化后腫瘤內皮樣細胞進行靶向治療，有望為卵巢癌提供潛在的治療靶點。

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Molecularmechanismofretrodifferentiationfromepithelialovariancancercellsinducedbyhypoxia

CHEN Mo1,YIN Xiao-jun2,YAO Liang-qing1,LI Na1,ZHU Peng-fei1,XU Cong-jian1

(1DepartmentofGynecology,ObstetricsandGynecologyHospital,FudanUniversity,Shanghai200001,China;2DepartmentofGynecology,TheSecondPeople’sHospitalofKunshanCity,Kunshan215300,China.E-mail:yaoliangqingcn@126.com)

AIM: To investigate the molecular mechanism of retrodifferentiation from epithelial ovarian cancer into vascular endothelial-like cells induced by hypoxia.METHODSThe three-dimensional culture system with Matrigel was established to culture SKOV-3 and ES-2 ovarian cancer cell lines under hypoxic condition (1％ O2).Telomeric repeat amplification protocol (TRAP) and real-time RT-PCR were used to analyze the activity of telomerase and the mRNA expression of cyclin D1,p53 and v-src in endothelial-like cells differentiated from the microdissected tumors.The data were compared with those in original cancer cells and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).RESULTSThe activity of telomerase was positive in SKOV-3 and ES-2 cells under normoxic condition,and was positive in SKOV-3 endothelial-like cells but negative in ES-2 endothelial-like cells under hypoxic condition.The mRNA expression of cyclin D1 in SKOV-3 and ES-2 endothelial-like cells with hypoxia was significantly lower than that in the same cells with normoxia (Plt;0.01),but was not significantly different from that in HUVECs (Pgt;0.05).In SKOV-3 and ES-2 endothelial-like cells,the mRNA expression of p53 was higher with hypoxia than that with normoxia.No expression of v-src mRNA in all kinds of the cells under either hypoxic or normoxic condition was detected.CONCLUSIONHypoxia induces the differentiation of SKOV-3 and ES-2 cells into vascular endothelial-like cells by decreasing telomerase activity and cyclin D1 expression,and the increasing the mRNA expression of p53.

Ovarian neoplasms; Hypoxia; Vascular endothelial-like cells; Cell differentiation; Telomerase; Cyclin D1; Genes,p53; Genes,v-src

1000-4718(2011)05-0848-05

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.004

2011-01-31

2011-04-15

上海市科委自然科學基金資助項目(No.08ZR1401900)；高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(No.20070246020)

△通訊作者 Tel：021-63450944；E-mail：yaoliangqingcn@126.com