點地梅提取物saxifragifolin B體外抗實體瘤活性研究*

李朋軍， 沈偉哉， 葉文才， 張冬梅， 孫 艷

(暨南大學1醫學院，2藥學院，廣東 廣州 510632；3廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006)

點地梅提取物saxifragifolin B體外抗實體瘤活性研究*

李朋軍1， 沈偉哉1， 葉文才2， 張冬梅2， 孫 艷3△

(暨南大學1醫學院，2藥學院，廣東 廣州 510632；3廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006)

目的： 初步探討點地梅提取物saxifragifolin B體外抗實體瘤活性及其作用機制。方法Saxifragifolin B作用于體外培養的人肝癌細胞BEL-7402、肺癌細胞A549和胃癌細胞SGC7901。光鏡下觀察腫瘤細胞形態學變化；AO/EB雙染法觀察細胞死亡；MTT法檢測細胞增殖水平，計算IC50；流式細胞術檢測細胞凋亡和壞死。結果Saxifragifolin B誘導3種實體瘤細胞出現凋亡樣和壞死樣改變。Saxifragifolin B以濃度依賴的方式抑制腫瘤生長，作用24 h IC50分別為13.13 μmol/L、9.61 μmol/L和11.64 μmol/L。Saxifragifolin B可以誘導腫瘤細胞凋亡和壞死。結論點地梅提取物saxifragifolin B具有抗多種實體瘤的活性，其作用機制可能與誘導細胞凋亡和促進細胞壞死有關。

點地梅； Saxifragifolin B； BEL-7402細胞； A549細胞； SGC7901細胞

天然產物廣泛存在于自然界，資源豐富而且類型多樣，因此是目前發展抗腫瘤藥物最重要的策略之一[1]。我國傳統中藥是天然產物的重要來源。中藥中提取的多種天然產物顯示了良好的抗腫瘤活性[2,3]。近來，有研究報道從報春花科(Primulaceae)點地梅屬植物點地梅[Androsaceumbellata(Lour.)Merr.]中首次分離得到7種化合物[4]，并發現三萜皂苷saxifragifolin B可以誘導肝癌細胞株HepG2凋亡[5]。本實驗通過研究saxifragifolin B對人肝癌細胞BEL-7402、肺癌細胞A549和胃癌細胞SGC7901形態及增殖的影響，初步探討點地梅提取物saxifragifolin B對其它實體瘤細胞株的抑制作用及機制，為深入闡明saxifragifolin B抗腫瘤作用機制及其臨床應用奠定基礎。

材 料 和 方 法

1藥物

Saxifragifolin B，白色無結晶粉末，經鑒定為3-O{β-D-吡喃木糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖(1→2)]-α-L-阿拉伯糖}-16α-羥基-13β，28-環氧-齊墩果烷-30-醛，saxifragifolin B結構見圖1，暨南大學藥學院葉文才教授惠贈。用二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解saxifragifolin B，制備濃度為20 mmol/L的儲存液，-20 ℃保存。

Figure 1.Chemical structure of saxifragifolin B.

2細胞株

人肝癌細胞株BEL-7402、人肺腺癌細胞株A549和人胃癌細胞株SGC7901由暨南大學生化教研室提供。

3主要試劑

RPMI-1640購自Gibco，胎牛血清購自杭州四季青公司，丫啶橙(acridine orange，AO)、溴化乙啶(ethidium bromide,EB)購自Fluka，MTT購自Sigma，AnnexinⅤ-FITC 凋亡檢測試劑盒購自Biovision。

4方法

4.1AO/EB雙熒光染色 收集對數生長期的腫瘤細胞。完全培養基(含10％胎牛血清的RPMI-1640)調整細胞濃度，按1×106cells/well接種24孔板，saxifragifolin B處理6h后，PBS洗2遍，滴加2 μL熒光標記物(AO/EB各含100mg/L)，避光染色，PBS洗2遍，滴加90％甘油，熒光顯微鏡下觀察拍照。設置陰性對照組(加入1‰DMSO)。

4.2MTT法檢測細胞增殖 收集對數生長期的細胞。完全培養基調整細胞濃度，按7×103cells/well接種96孔板。設置空白對照組、陰性對照組和6個實驗組，每組設置4個復孔。細胞接種24 h后加入saxifragifolin B，使其終濃度為4 μmol/L、6 μmol/L、8 mol/L、10 μmol/L、12 μmol/L、14 μmol/L。空白對照組加入等體積完全培養基。陰性對照組加入1‰DMSO。分別于藥物作用24 h、48 h、72 h后，加MTT(10 g/L)繼續培養4 h。棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶解，待完全溶解后振蕩均勻，酶標儀測定490 nm處A值。計算半數抑制濃度(50％ inhibition concentration,IC50，μmol/L)。培養人臍靜脈內皮細胞株HUVECs，按以上MTT方法檢測saxifragifolin B作用24 h對正常細胞的毒性作用，計算半數致死濃度CC50(50％ cytotoxicity concentration)。

4.3流式細胞術檢測細胞凋亡和壞死 按試劑盒說明書操作。收集對數生長期的腫瘤細胞。完全培養基調整細胞濃度，按5×105cells/well接種6孔板。細胞接種24 h后加入saxifragifolin B。設置陰性對照組。藥物作用24 h后收集細胞，PBS洗2次。500 μL binding buffer重懸細胞，加5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，室溫避光染色5 min后流式細胞儀檢測。

5統計學處理

結 果

1SaxifragifolinB對3種實體瘤細胞生長的影響

Saxifragifolin B 作用24 h，3種實體瘤細胞出現明顯的形態學變化。對照組BEL-7402、A549、SGC7901細胞體外培養24 h分別呈多邊形、梭形、錐形或三角形，見圖2A、C、E。細胞折光性好，生長狀態良好，可見較多分裂細胞。而實驗組的3種腫瘤細胞形態表現相似，細胞數明顯減少。部分細胞變圓，體積增大，無折光性，周圍可見較多細胞碎片；部分細胞體積縮小，形成小泡，見圖2B、D、F。用AO/EB雙染觀察saxifragifolin B作用后腫瘤細胞死亡情況，結果顯示藥物作用6h即出現明顯的細胞死亡：部分腫瘤細胞體積增大，染色質呈均勻的橙紅色、部分細胞核擴張或黃綠色熒光減少消失(壞死細胞)；部分細胞核則呈現致密濃染的黃綠色熒光(凋亡細胞)，見圖3B、C。對照組細胞核完整、呈均勻綠色淡染，見圖3A。

2SaxifragifolinB抑制3種實體瘤細胞增殖

不同濃度藥物作用不同時間，結果顯示saxifragifolin B對3種實體瘤細胞的增殖均具有抑制作用。Saxifragifolin B抑制同種腫瘤細胞的作用強度在24 h、48 h和72 h時相差不大，說明saxifragifolin B的抗腫瘤作用不隨時間延長而增強；但在一定濃度范圍內，抑制作用隨著濃度增加而增強，見圖4-6。正常細胞毒性試驗結果顯示，saxifragifolin B對正常細胞的CC50為(21.79±1.05)μmol/L。而saxifragifolin B抑制實體瘤的IC50水平在10 μmol/L左右，見表1。

Figure 2.Effect of saxifragifolin B on the growth of BEL-7402,A549 and SGC7901 cells(×200).A: control group of BEL-7402 cells for 24 h; D: BEL-7402 cells were treated with 10 μmol/L saxifragifolin B for 24 h; B: control group of A549 cells for 24 h; E: A549 cells were treated with 10 μmol/L saxifragifolin B for 24 h; C: control group of SGC7901 cells for 24 h; F: SGC7901 cells were treated with 10 μmol/L saxifragifolin B for 24 h.

Figure 3.Saxifragifolin B induced apoptosis and necrosis in BEL-7402 cells(×400).Cells were stained with both AO and EB.Triangle：necrosis.Arrow: apoptosis.A: control group cells for 6 h;B: BEL-7402 cells were treated with 10 μmol/L saxifragifolin B for 6 h;C: BEL-7402 cells were treated with 12 μmol/L saxifragifolin B for 6 h.

Figure 4.Saxifragifolin B inhibited the proliferation of BEL-7402 cells.±s.n=4.

Figure 5.Saxifragifolin B inhibited the proliferation of A549 cells±s.n=4.

Figure 6.Saxifragifolin B inhibited the proliferation of SGC7901 cells±s.n=4.

3SaxifragifolinB誘導腫瘤細胞凋亡和壞死

Annexin V/PI雙染檢測腫瘤細胞死亡情況，結果顯示8 μmol/L作用24 h既誘導部分腫瘤細胞發生早期凋亡(Annexin V-FITC+)，又促進部分腫瘤細胞壞死(PI+)，見圖7。Saxifragifolin B處理組腫瘤細胞凋亡和壞死水平分別與對照組相比存在顯著差異(Plt;0.01)，見圖8、9。上述結果說明saxifragifolin B可以顯著誘導3種實體瘤細胞凋亡和壞死。

表1 Saxifragifolin B對3種實體瘤細胞的增殖抑制作用

Figure 7.Saxifragifolin B induced apoptosis and necrosis in SGC7901 cells.SGC7901 cells were stained by Annexin V-FITC(FL1) and PI(FL3).Levels of apoptosis and necrosis were analysis by flow cytometry.A: control group cells for 24 h; B: SGC7901 cells were treated with 4 μmol/L saxifragifolin B for 24 h; C: SGC7901 cells were treated with 8 μmol/L saxifragifolin B for 24 h.

Figure 8.Apoptosis induced by saxifragifolin B in three kinds of solid tumors±s.n=3.Three kinds of solid tumors were treated with 8μmol/L saxifragifolin B for 24 h.Apoptotic rate was analyzed by flow cytometry.**Plt;0.01 vs control.

Figure 9.Necrosis induced by saxifragifolin B on three kinds of solid tumors±s.n=3.Three kinds of solid tumors were treated with 8 μmol/L saxifragifolin B for 24 h.Necrotic rate was analyzed by flow cytometry.**Plt;0.01 vs control.

討 論

點地梅是報春花科點地梅屬多年生植物，其全草均可入藥，《中藥大辭典》載:“性味苦寒，功效利水，主治熱性水腫”，民間用全草治療扁桃腺炎、咽喉炎、口腔炎，故有喉嚨草之稱[6]。李承花[4]利用硅膠柱層析、Sephadex LH20柱層析以及反相柱層析等方法分離純化點地梅全草得到7種化合物，通過理化性質和波譜技術鑒定分別為山柰酚(kaempferol)、蘆丁(rutin)、槲皮素(quercetin)、primulanin、saxifragifolin B和saxifragifolin D和胡蘿苷(daucosterol)。Park等[7]也通過甲醇提取，正丁醇萃取，柱層析等方法獲得4種三萜皂苷：saxifragifolin C、saxifragifolin A、saxifragifolin B和saxifragifolin D。點地梅正丁醇粗提物具有抗腫瘤活性[8]。其中，saxifragifolin B可以誘導肝癌細胞株HepG2凋亡[4]，而4種三萜皂苷saxifragifolin C、saxifragifolin A、saxifragifolin B和saxifragifolin D對多藥耐藥腫瘤細胞株和非多藥耐藥腫瘤細胞株均有較敏感的抑制作用[7]。

本研究探討了點地梅提取物saxifagifolin B對其它實體瘤的作用，結果發現saxifragifolin B對人肝癌細胞BEL-7402、肺癌細胞A549和胃癌細胞SGC7901均有抑制作用，且與Saxifagifolin B致正常內皮細胞的毒性作用相比較強(見結果2)。但與文獻報道[5]不同的是，我們發現saxifragifolin B抑制實體瘤的作用具有濃度依賴性，但沒有時間依賴性，6 h即可見明顯的細胞死亡。形態學觀察顯示：saxifragifolin B作用后3種實體瘤的形態學表現相似。部分腫瘤細胞呈壞死樣改變；而部分細胞呈凋亡樣改變。進一步采用流式檢測發現，saxifragifolin B既能誘導3種實體瘤發生早期凋亡，又能直接導致細胞壞死。提示saxifragifolin B抑制腫瘤的作用沒有明顯的選擇性，其作用機制可能同時存在誘導細胞凋亡和促進壞死。

以往研究僅報道了saxifragifolin B誘導凋亡的作用[5,7]，并發現caspase-8/caspase-3、線粒體細胞色素C/caspase-9途徑參與了凋亡發生。然而越來越多的報道顯示，促進腫瘤發生被動性細胞死亡也是抗腫瘤藥物重要的作用機制之一。其中，以細胞腫脹、胞漿空泡形成、無染色質濃縮的核擴張為特點的細胞脹亡(oncosis)備受關注[9]。Du等[10]發現青蒿琥酯(artesunate)有選擇性抗胰腺癌細胞Panc-1、 BxPC-3 和 CFPAC-1活性，電鏡觀察藥物作用后腫瘤細胞呈脹亡的典型表現。這種細胞死亡與caspase分子無關，但可被活性氧(ROS) 清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine，NAC)抑制。本研究初步的形態學觀察和流式檢測顯示，saxifragifolin B可誘導腫瘤發生具有脹亡特點的形態學表現(如細胞變大、核擴張)及細胞被動性壞死，但saxifragifolin B是否通過脹亡途徑誘導腫瘤死亡還需進一步的實驗確定。

本研究證實saxifragifolin B具有潛在廣譜抗實體瘤活性，而其抗腫瘤作用機制的深入闡明將有助于發展saxifragifolin B的臨床應用。

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ActivityofsaxifragifolinBfromAndrosaceumbellataagainstsolidtumorsinvitro

LI Peng-jun1,SHEN Wei-zai1,YE Wen-cai2,ZHANG Dong-mei2,SUN Yan3

(1SchoolofMedicine,2CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3LifeScienceandBiopharmaceuticalCollege,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China.E-mail:sxmshw77@163.com)

AIM: To investigate the activity of saxifragifolin B fromAndrosaceumbellataagainst solid tumors.METHODSHuman hepatoma cell line BEL-7402,human lung adenocarcinoma epithelial cell line A549 and human gastric cancer cell line SGC7901 were treated with saxifragifolin Binvitro.Morphological changes of the tumor cells were observed under microscope.Cell deaths were determined by AO/EB double staining.Cell proliferation was assayed by MTT method.The IC50values were graphically determined.Apoptosis and necrosis were measured by flow cytometry.RESULTSSaxifragifolin B induced apoptosis and necrosis in all 3 tested solid tumor cells.Saxifragifolin B inhibited proliferation of tumor cells in a concentration-dependent manner with IC50values of 13.13 μmol/L,9.61 μmol/L and 11.64 μmol/L at 24 h,respectively.Saxifragifolin B induced both apoptosis and necrosis in the tumor cells.CONCLUSIONSaxifragifolin B fromAndrosaceumbellatahas the activity against a variety of solid tumors with the possible mechanisms of inducing both apoptosis and necrosis.

Androsaceumbellata; Saxifragifolin B; BEL-7402 cells; A549 cells; SGC7901 cells

1000-4718(2011)05-0838-05

R931.71

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.002

2011-01-05

2011-03-08

國家自然科學基金資助項目(No.81000923)；廣東省醫學科學技術研究基金資助項目(No.B2009117);廣東高校優秀青年創新人才培育資助項目(No.2009400)

△通訊作者Tel:020-31897359; E-mail: sxmshw77@163.com