氯通道在華蟾酥毒基誘導的鼻咽癌細胞凋亡中起重要作用*

柏志全, 李春英, 李 媛, 馬文波, 朱林燕, 葉文才, 張冬梅, 王立偉△, 陳麗新△

(暨南大學 1醫學院生理系，2醫學院藥理系，3藥學院中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632)

·論著·

氯通道在華蟾酥毒基誘導的鼻咽癌細胞凋亡中起重要作用*

柏志全1 ▲, 李春英1 ▲, 李 媛2, 馬文波1, 朱林燕2, 葉文才3, 張冬梅3, 王立偉1△, 陳麗新2△

(暨南大學1醫學院生理系，2醫學院藥理系，3藥學院中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632)

目的： 研究氯離子通道在華蟾酥毒基(CBG)誘導低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞凋亡和凋亡性容積減小中的作用。方法實驗設立空白對照組、CBG高、中、低劑量組及CBG與氯通道阻斷劑NPPB 聯合作用組。Hoechst 33342染色檢測細胞的凋亡率，活細胞圖像分析法檢測細胞容積變化，全細胞膜片鉗法記錄氯電流。結果(1)CBG濃度依賴性誘導鼻咽癌細胞凋亡，高劑量CBG(8 μmol/L)誘導的細胞凋亡率為43.2％；(2)CBG可誘導細胞產生凋亡性容積減小，在CBG作用早期(50 min),細胞容積減小約9.9％。(3)CBG可激活氯通道，產生一個無明顯外向優勢的氯電流。(4)氯通道阻斷劑NPPB可抑制CBG誘導的細胞凋亡、凋亡性細胞容積減小和氯電流。NPPB對CBG誘導的細胞凋亡和凋亡性容積減小的抑制率分別達80.1％和74.8％。結論以上結果提示CBG可能通過激活氯通道而誘導細胞凋亡，氯通道的激活可能在CBG抗腫瘤機制中起重要作用。

華蟾酥毒基； 凋亡； 氯通道； 凋亡性細胞容積減小

蟾酥是一種名貴的中藥，其含有多種化學成分，具有抗腫瘤、強心、鎮痛、升壓等多種藥理活性。蟾酥對多種惡性腫瘤，如肝癌、胰腺癌、結腸癌、白血病等，均有較好療效，對癌性疼痛亦有一定緩解作用，并可用于防治惡性腫瘤的復發和轉移[1,2]。文獻報道，蟾酥中含量較高、藥理活性較強的蟾蜍內酯類成分單體-華蟾酥毒基 (又稱華蟾毒精，cinobufagin，CBG) 對人肝癌細胞、宮頸癌細胞、乳腺癌細胞和白血病等人體腫瘤細胞增殖和凋亡都有抑制作用[1-3]，但其作用機制目前尚不明確。我們前文報道化療藥物順鉑抑癌作用機制之一是激活氯通道，誘導細胞凋亡[4]。本研究對華蟾酥毒基進行體外實驗研究，觀察其對鼻咽癌細胞凋亡的影響，研究其抗癌機制，探討氯離子通道在華蟾酥毒基抗腫瘤中的作用。

材 料 和 方 法

1腫瘤細胞株

低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞常規培養于含10％小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640生長液中，置于37 ℃、飽和濕度、5％CO2孵箱培養，按常規方法傳代。

2藥品及試劑

氯通道阻斷劑5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoate (NPPB)為Sigma產品，NPPB用DMSO配制成100 mmol/L儲存液，使用終濃度為 100 μmol/L，DMSO最高終濃度為0.2％。Hoechst 33342/PI熒光染料購自南京凱基生物科技發展有限公司。華蟾酥毒基(純度為95％)由暨南大學藥學院提供，用DMSO配制成1 mmol/L儲存液，置于4 ℃保存，臨用前用等滲灌流液稀釋到終濃度。等滲灌流液滲透壓為300 mOsmol /L，成分包括(mmol/L)：70 NaCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES 和140 D-甘露醇。用冰點滲透壓計(Osmomat 030,Gonotec)檢測滲透壓。灌流液pH值用Tris液調到7.4。

3細胞容積測量

將細胞懸液滴在小玻片上孵育1 h使其貼壁。實驗時將細胞玻片安放在特制浴槽中。在倒置相差顯微鏡(IX71,Olympus)下選擇固定視野連續拍攝細胞圖像。用數字式攝像機 (Retiga 4000R,QImaging) 連接相差顯微鏡與計算機，用Scion Image 圖像分析軟件(Scion Corporation)控制拍攝，每隔60s拍攝細胞圖像1幅，分析和測量細胞體積。細胞容積經標準化處理。標準化細胞容積(standardization cell volume，Vst)按Vst=(Vt/Vo)×100 公式計算，其中Vt是實時測得的細胞容積，Vo是同一細胞在等滲條件下的平均容積。實驗設立空白對照組、華蟾酥毒基組 (8 μmol/L)、華蟾酥毒基(8 μmol/L)與氯通道阻斷劑NPPB(100 μmol/L)聯合作用組，實驗時先用等滲液灌流5 min，然后分別給予華蟾酥毒基或華蟾酥毒基與NPPB灌流50min,空白對照組不給任何處理。所有實驗在室溫(20-24 ℃)下進行，重復3 次。

4Hoechst33342染色檢測細胞凋亡

實驗分為正常對照組、低劑量華蟾酥毒基組(0.1 μmol/L)、中劑量華蟾酥毒基組(4 μmol/L)、高劑量華蟾酥毒基組(8 μmol/L)、NPPB 組(100 μmol/L)、NPPB(100 μmol/L)與華蟾酥毒基(8 μmol/L)聯合作用組。24孔板培養， 1.1×105cells/well，藥物作用48 h后丟棄原培養液，PBS洗滌2次，每次3 min，每孔加入Hoechst 33342 10 μL和1 mL PBS混勻液，3 7℃孵育10-15 min。PBS洗滌1次。各孔加入1 mL的Buffer A工作液,室溫避光放置15 min。在倒置熒光顯微鏡下隨機計數300個細胞，辨認凋亡細胞和活細胞，細胞核或細胞質內見濃染致密的顆粒狀亮藍色熒光者為凋亡細胞，呈彌散均勻的淡藍色熒光者為活細胞，計算凋亡率。每組均設3個復孔，并重復3 次。

5膜片嵌全細胞法記錄氯電流

用EPC-7膜片鉗放大器(Heka,Lambrecht/Pfalz)記錄單個鼻咽癌CNE/2Z的全細胞電流。使用外徑為1.5 mm、內徑為0.86 mm的硼硅酸鹽毛細玻璃管，在微電極拉制器(PB-7)上分兩步拉制微電極。微電極尖端的電阻5-10 MΩ。電流和電壓信號用CED1401(CED，Cambridge)數字化(采樣頻率3 kHz),實驗數據用EPC(CED,Cambridge)軟件分析。電壓鉗制模式：細胞被鉗制在0 mV,以0 mV、±40 mV、±80 mV順序不斷反復循環，每個鉗制脈沖波寬200 ms，間隔4 s。細胞玻片安置在灌流槽中，實驗在室溫(20-24 ℃)下進行。

6統計學處理

結 果

1華蟾酥毒基誘導鼻咽癌細胞凋亡

在熒光顯微鏡下可見，正常對照組的細胞狀態良好，少見凋亡和壞死細胞,熒光染料Hoechst 33342可以少許進入正常細胞，正常細胞核Hoechst33342著色的形態呈圓形，染色質分布均勻，染上淡藍色，而在華蟾酥毒基(8 μmol/L)作用下，誘導細胞凋亡，表現為進入細胞的Hoechst 33342增多，熒光強度較高,部分細胞的核由于濃集而呈亮藍色，有明顯的凋亡小體出現，核染色質凝集及邊聚化，部分核染色體碎片狀，核呈固縮狀或圓珠狀，見圖1。進一步分析顯示，華蟾酥毒基濃度依賴性誘導細胞凋亡，華蟾酥毒基低、中、高劑量組作用48 h后，細胞凋亡率分別為(1.9±2.5)％、(27.9±2.5)％和(43.2±3.3)％。

Figure 1.Inhibition of cinobufagin-induced apoptosis by the chloride channel blocker NPPB (Hoechst 33342 fluorescent staining,×280).CBG: 8 μmol/L cinobufagin; CBG+NPPB: 8 μmol cinobufagin + 100 μmol/L NPPB.

2氯通道阻斷劑抑制華蟾酥毒基誘導的細胞凋亡

在氯通道阻斷劑NPPB(100 μmol/L)的單獨作用下，細胞狀態較好，細胞中的熒光較弱，染色質分布均勻，少見凋亡和壞死細胞。在加入華蟾酥毒基(8 μmol/L)的同時，聯合應用氯通道阻斷劑NPPB(100 μmol/L)，結果顯示NPPB顯著抑制華蟾酥毒基誘導的細胞凋亡。細胞凋亡小體較之單純華蟾酥毒基組少，熒光強度也較弱,見圖1，凋亡率從華蟾酥毒基組(43.2±3.3)％下降到(8.6±2.9)％，Plt;0.01，抑制率為80.1％。

3華蟾酥毒基誘導的凋亡性細胞容積減小

當細胞處于等滲液中，連續灌流55 min細胞容積和細胞形態基本穩定不變。而在細胞外灌流華蟾酥毒基后，細胞體積逐漸縮小，皺縮，部分細胞由圓形變為不規則狀。圖2顯示了等滲液對照組和8 μmol/L華蟾酥毒基組細胞0、30、50 min時的細胞圖像。圖像分析結果表明，細胞受到華蟾酥毒基刺激50 min后，可檢測到細胞容積縮小到加藥前等滲對照值的(90.1±0.9)％。

4氯通道阻斷劑抑制華蟾酥毒基誘導的凋亡性細胞容積減小

細胞外灌流氯通道阻斷劑NPPB時，明顯抑制華蟾酥毒基誘導的細胞容積減小，圖3顯示了對照組和藥物作用前后55 min內細胞容積變化的連續過程。在華蟾酥毒基作用50 min時，細胞容積縮小至(90.1±0.9)％,Plt;0.01。華蟾酥毒基和NPPB聯合作用50 min時細胞容積僅減小至(97.5±0.7)％，與華蟾酥毒基組相比差異顯著(Plt;0.01)。氯通道阻斷劑NPPB對華蟾酥毒基誘導的凋亡性細胞容積縮小的抑制率達(74.8±4.5)％，顯著抑制華蟾酥毒基誘導的凋亡性細胞容積減小，見圖3。本結果提示華蟾酥毒基可能通過激活細胞氯通道而誘導凋亡性細胞容積減小。

Figure 2.Cell images taken during the process of apoptotic volume decrease induced by cinobufagin.ISO: isotonic solution; CBG: 8 μmol/L cinobufagin.

Figure 3.Inhibition of cinobufagin-induced apoptotic volume decrease by the chloride channel blocker NPPB.CBG: 8 μmol/L cinobufagin; NPPB+CBG: 100 μmol/L NPPB +8 μmol/L cinobufagin±sE.n=6

5華蟾酥毒基可以激活CNE/2Z細胞上的氯通道

當細胞處于等滲液中，可以記錄一個穩定且較小的氯電流,見圖4A，當膜電位分別鉗制于-80 mV和80 mV時，細胞平均電流密度分別為(-3.2±0.3)pA/pF和(3.5±0.3)pA/pF。用含5 μmol/L華蟾酥毒基的等滲液灌流細胞可以激活氯電流，細胞平均電流分別增大至(-71.1±7.7)pA/pF(鉗制電壓：-80 mV)和(66.9±6.2)pA/pF(鉗制電壓：80 mV)(Plt;0.01)。結果顯示，華蟾酥毒基激活的氯電流無明顯的外向或內向優勢,見圖4B。細胞外灌流氯通道阻斷劑NPPB(100 μmol/L)可明顯抑制華蟾酥毒基所激活的氯電流，見圖4C。圖4D和4E分別顯示了華蟾酥毒基激活氯電流和NPPB抑制該電流的全過程以及不同處理時的電流-電壓關系。

Figure 4.Cinobufagin-induced chloride currents.CBG: 5 μmol/L cinobufagin; CBG+NPPB: 5 μmol/L cinobufagin + 100 μmol/L NPPB.**Plt;0.01 vs ISO+CBG±sE.n=6.A: control; B: cinobufagin; C: cinobufagin+NPPB; D: the time course of inhibition of cinobufagin challenge-induced chloride currents by NPPB; E: current-voltage relationship.ISO: isotonic solution.

討 論

用抗癌藥進行化療在腫瘤的綜合治療中占有極其重要的地位。抗癌藥可通過誘導腫瘤細胞分化，抑制腫瘤細胞增殖或/和誘導瘤細胞凋亡等不同環節而起抗癌作用。然而大多數實體瘤的治療目前仍未能達到滿意的效果。發現抗癌藥物作用新靶點，從天然產物中尋找新的抗癌藥物是藥物研發工作的重點之一。

蟾酥為我國名貴中藥,為蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液,經加工干燥制成。蟾酥化學成分很復雜，在蟾酥近百種已鑒定結構的化學成分中,其中3種化合物包括蟾蜍靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基有較明顯的體外抗腫瘤作用。文獻報道，蟾酥對白血病、胃癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤有顯著的抗腫瘤作用，還能不同程度地防治化療和放療引起的白細胞下降，在腫瘤治療中有較好的發展前景[1，2]。研究表明,蟾毒內酯類可能通過阻滯細胞周期進程，干擾癌細胞蛋白質合成等而起抗腫瘤作用[3,5]。但迄今為止，人們對蟾酥抗癌機制認識不深，因此限制了將蟾毒內酯類開發應用于臨床癌癥治療。

CBG是蟾酥中的一種活性單體，實驗證明其具有抗白血病和抗肝癌作用。微量的CBG可誘導白血病HL-60細胞凋亡,有顯著的抑制生長作用[5]。CBG的抗癌作用機制可能是多方面的,誘導肝癌細胞周期G2/M期阻滯可能是CBG抑制肝癌細胞增殖的重要機制，CBG可使人肝癌SMMC-7721和BEL-7402細胞停滯于G2/M期,減少S期的細胞比例,減少肝癌細胞S期DNA含量及增殖指數,并誘導肝癌細胞凋亡[4,6]，提示CBG可能通過影響細胞周期進程而誘導細胞凋亡。本實驗結果顯示，CBG誘導鼻咽癌細胞凋亡，進一步證實了CBG的抗鼻咽癌作用,表明CBG是中藥蟾酥的主要抗腫瘤成分之一。

我們前期的研究工作表明， Cl-通道在細胞周期調節、細胞增殖、凋亡和細胞遷移等重要生理病理過程中起重要作用[7-9]。鼻咽癌主要化療藥物-順鉑誘導的鼻咽癌細胞發生凋亡的早期，激活細胞膜Cl-通道[4,10]。近年來越來越多證據表明，Cl-通道的激活是細胞凋亡發生過程的一個交匯點，在細胞凋亡早期觸發機制中發揮關鍵性作用。在凋亡早期，Cl-通道和K+通道被激活，引起Cl-和K+外流，同時伴隨水的外流而導致凋亡性細胞皺縮，誘導細胞凋亡。Cl-通道和K+通道的激活是細胞凋亡性生化變化的上游事件，激活Cl-通道和K+通道，誘導細胞發生凋亡性容積減小是抗癌藥作用的潛在的新靶點。蟾酥可否通過激活Cl-通道而誘導細胞發生凋亡？目前國內外尚沒有相關的報道。為了研究Cl-通道在華蟾酥毒基抗腫瘤中的作用，本實驗觀察了華蟾酥毒基對氯通道的作用，以及阻斷Cl-通道對華蟾酥毒基誘導凋亡和凋亡性容積減小作用的影響。結果表明，華蟾酥毒基可激活氯通道，氯通道阻斷劑NPPB可以顯著地抑制華蟾酥毒基誘導的氯電流，拮抗華蟾酥毒基引起的細胞凋亡性容積減小和細胞凋亡，提示華蟾酥毒基可能通過激活氯通道而誘導細胞凋亡，氯通道在華蟾酥毒基抗腫瘤中起重要作用。本實驗的完成，加深了我們對華蟾酥毒基的抗癌機制的認識，為研發離子通道介導的蟾毒內酯類化合物抗腫瘤藥物提供了新的實驗依據。

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Rolesofchloridechannelsinapoptosisinducedbycinobufagininnasopharyngealcarcinomacells

BAI Zhi-quan1,LI Chun-ying1,LI Yuan2,MA Wen-bo1,ZHU Lin-yan2,YE Wen-cai3,ZHANG Dong-mei3,WANG Li-wei1,CHEN Li-xin2

(1DepartmentofPhysiology,2Departmentofpharmacology,SchoolofMedicine,3InstituteofTraditionalChineseMedicineandNaturalProducts,CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:wangliweic@sohu.com;chenlixinw@sohu.com)

AIM: To investigate the roles of chloride channels in the apoptosis and apoptotic volume decrease(AVD) induced by cinobufagin in nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells.METHODSFive experimental groups in this study were set up,including control group,cinobufagin groups treated with low,medium or high concentration of cinobufagin alone,and the combination group treated with cinobufagin and the chloride channel blocker 5-nitro-2- (3-phenylpropylamino) -benzoate (NPPB).Apoptotic rates were detected by Hoechst 33342 staining and the volume changes were measured by the method of time-lapse live cell imaging.The patch clamp technique was used to record whole-cell chloride currents.RESULTSCinobufagin induced apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells in a concentration-dependent manner.The apoptotic rate was 43.2％ in the cells treated with cinobufagin at high concentration (8 μmol/L).An AVD was observed in the cells treated with cinobufagin.Cinobufagin decreased the cell volume by 9.9％ in 50 min and activated a chloride current which did not show significant outward rectification.The chloride channel blocker NPPB inhibited the cinobufagin-induced apoptosis,AVD and chloride currents.NPPB decreased the cinobufagin-induced apoptosis and AVD by 80.1％ and 74.8％,respectively.CONCLUSIONOur findings suggest that cinobufagin induces apoptosis by activation of chloride channels,which may play an important role in the anti-tumour action of cinobufagin.

Cinobufagin; Apoptosis; Chloride channels; Apoptotic volume decrease

1000-4718(2011)05-0833-05

R739.63

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.001

2011-02-27

2011-04-19

國家自然科學基金資助項目 (No.30771106；No.30870567；No.30871267；No.90913020；No.U0932004)；廣東省自然科學基金資助項目(No.07005974)

△通訊作者 Tel: 020-85220260；E-mail: wangliweic@sohu.com; Tel: 020-85228865；E-mail: chenlixinw@sohu.com

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