Intermedin1-53對大鼠心肌成纖維細胞增殖的影響*

薛立華， 梁 穎， 宋君秋， 齊永芬， 賈月霞△

(1寧夏醫科大學基礎醫學院病理生理學系，寧夏 銀川 750004；2北京大學醫學部生理與病理生理學系，北京 100083)

Intermedin1-53對大鼠心肌成纖維細胞增殖的影響*

薛立華1， 梁 穎1， 宋君秋2， 齊永芬2， 賈月霞1△

(1寧夏醫科大學基礎醫學院病理生理學系，寧夏 銀川 750004；2北京大學醫學部生理與病理生理學系，北京 100083)

目的研究intermedin1-53(IMD1-53)對醛固酮(ALD)促SD乳鼠心肌成纖維細胞(CFBs)增殖的影響及細胞外信號調節激酶(ERK)信號轉導途徑的作用。方法分離培養SD乳鼠CFBs，將細胞分成對照組、不同濃度ALD組、ALD+不同濃度IMD1-53組，用MTT比色法測定細胞活性。通過Western blotting方法觀察IMD1-53對ALD誘導的p-ERK蛋白表達的影響。結果(1) IMD1-53對基礎狀態下的CFBs增殖無明顯抑制作用，但能呈濃度(10-9～10-7mol/L)依賴性地抑制ALD刺激CFBs的增殖。(2) IMD1-53具有濃度(10-9～10-7mol/L)依賴性地抑制ALD誘導的p-ERK蛋白表達的作用。結論IMD1-53通過ERK信號途徑抑制ALD促CFBs增殖的效應。

Intermedin1-53； 心肌成纖維細胞； 醛固酮; ERK通路

流行病學研究顯示，心肌纖維化是心室重構的主要病理特征之一，纖維化的改善使肥厚或不肥厚的心室組織的僵硬度減輕，并且心血管事件相關危險性減少。因此，尋找有效抑制并逆轉心肌纖維化的措施具有重要臨床價值。Intermedin1-53(IMD1-53)是Roh等[1]用系統進化分析法以降鈣素基因相關肽(calcium gene-related peptide, CGRP)超家族成員特異的一二級結構檢索基因庫得到了該家族的一個新成員IMD，IMD的組織分布十分廣泛，下頜下腺、腎臟、胃腸道、肺臟、心臟、脾臟、胸腺、卵巢等組織中均有IMD表達[2]，提示IMD可能廣泛參與機體內環境穩態的調控。已有的研究表明，IMD可強力而持久地舒張血管、降低血壓，并可改善心功能，增加冠脈流量[3, 4]，是強效的心血管活性調節肽。但IMD1-53在心肌重塑、心肌纖維化過程中起何作用及其機制尚未完全清楚。本實驗通過檢測IMD1-53對心肌成纖維細胞(cardial myofibroblasts,CFBs)增殖的影響，并探討其可能的作用機制，為心肌纖維化的防治提供新的實驗室數據。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 選用出生1-4 d的雄性SD乳鼠，由北京大學醫學部實驗動物中心提供。

1.2主要試劑 合成的大鼠IMD1-53由美國Phoenix Pharmaceutical Inc.提供；DMEM培養基為Gibco產品，胰蛋白酶、MTT、醛固酮(aldosterone,ALD)、DMSO均為Sigma產品。胎牛血清購于Sigma。余為市售分析純產品。

1.3主要儀器 超凈工作臺(TDGC2J-I/0.5型，蘇州凈化設備有限公司)，酶聯免疫檢測儀(BioTek Instruments Inc.)，脫色搖床(DY-132江蘇興化市分析儀器廠)，Olympus CHC-212型光學顯微鏡，302型二氧化碳孵育箱(Shellab)，RC5C高速低溫冷凍離心機(Sorvall)，25 cm2培養瓶，96孔培養板，24孔板等。

2方法

2.1心臟成纖維細胞的培養和鑒定 取1-3 d齡的SD大鼠心臟，剪去包膜，剪成0.5～1.0 mm3小塊，用0.1%胰蛋白酶消化。在5% CO2、37 ℃培養箱中培養60 min，用差速貼壁法獲得心臟成纖維細胞[7]。對心臟成纖維細胞進行形態學和SABC法免疫細胞化學染色鑒定，純度達98%，選用2～4代的心臟成纖維細胞用于實驗。

2.2ALD對CFBs活性的MTT實驗 取對數生長期CFBs稀釋成5×104cells/well，均勻接種于96孔培養板上，每孔200 μL，37 ℃﹑5%CO2及飽和濕度條件下培養，24 h后換成含1%血清DMEM培養基。37 ℃繼續孵育24 h，吸棄原培養液，設空白對照組，10%胎牛血清組和3個不同濃度ALD(10-8～10-6mol/L)的實驗組繼續培養24 h，各組于藥物刺激結束前4 h，吸棄上清，加入MTT 20 μL，37 ℃繼續培養4 h后終止培養，吸棄孔內培養上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，在振蕩搖床上振蕩10 min使結晶充分溶解，在酶聯免疫檢測儀上570 nm處測定吸光度值(A570)。

2.3IMD1-53對ALD誘導CFBs膠原蛋白合成的影響 實驗共分6組，每組重復3孔，取平均數。(1)空白對照組：不加藥物； (2)10%血清組：不加藥物； (3)ALD組：加入10-6mol/L ALD； (4)～(6)在3個不同濃度IMD1-53(10-9mol/L～10-7mol/L)組中分別加入10-6mol/L ALD。嚴格按照試劑盒操作說明書測定上清液中羥脯氨酸在550 nm處的吸光度值(A值)，并根據公式計算羥脯氨酸含量，最后通過測羥脯氨酸含量得出膠原蛋白濃度。

2.4ALD對CFBs p-ERK蛋白表達的影響 實驗共分2組，每組重復3次，取平均數，實驗重復3次。(1)含1%胎牛血清細胞對照組：含有DMEM的培養液； (2)ALD組：培養液中加入10-6mol/L ALD，分別在不同時點(5 min、10 min、30 min)吸棄上清，從培養板上刮取細胞，放入1.5 mL試管中，考馬斯亮藍法進行蛋白定量，行SDS-PAGE電泳，每孔上樣量100 μg蛋白。轉移至硝酸纖維膜(NC模)后，用含5%脫脂奶粉的TBS[20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、0.05% Tween 20、0.6%NaCl]室溫下封閉1 h；羊抗大鼠p-ERK單克隆抗體、兔抗大鼠ERK單克隆抗體4 ℃孵育4 h；TBS洗脫3次后，分別加Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標記的鼠抗羊多克隆抗體、鼠抗兔多克隆抗體)室溫孵育1 h。TBS洗脫3次。利用化學發光法進行顯色反應。結果用專業軟件NIH ImageJ分析灰度值定量。

2.5檢測IMD1-53對ALD誘導CFBs p-ERK蛋白表達的影響 實驗共分4組，每組重復3孔，取平均數。(1)細胞對照組：含有DMEM的培養液； (2)IMD1-53組：培養液中加入10-7mol/L IMD1-53； (3)ALD組：培養液中加入10-6mol/L ALD； (4)(10-7mol/L)IMD1-53+(10-6mol/L) ALD組：培養液中分別同時加入10-7mol/L IMD1-53和10-6mol/L ALD，首先加入IMD1-53孵育10 min，再加入ALD共同孵育10 min，刮取細胞放入Appendorf管中，進行蛋白定量，Western blotting方法檢測CFBs p-ERK蛋白的表達。

3統計學處理

結 果

1ALD對CFBs活性的影響

與含1%胎牛血清組比較，10%胎牛血清組細胞活性值顯著升高(Plt;0.01)，說明10%胎牛血清組能夠明顯促進CFBs增殖；不同濃度(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)的ALD均能提高CFBs的活性，顯著高于對照組(Plt;0.01，Plt;0.05)；10-6mol/L ALD促進CFBs增殖水平與10%胎牛血清組比較無顯著差異，見圖1。結果顯示，ALD呈濃度依賴性地促進CFBs的增殖。

Figure 1. The viability of CFBs induced by ALD±s.n=3.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs control (without treatment).

2IMD1-53對ALD誘導CFBs膠原蛋白合成的影響

與含1%血清對照組比較，CFBs在10-6mol/L ALD的作用下羥脯氨酸含量明顯升高(Plt;0.01)，說明10-6mol/L ALD可顯著促進CFBs的膠原蛋白合成。CFBs在10-6mol/L ALD的作用下分別加入濃度為10-9mol/L IMD1-53、10-8mol/L IMD1-53、10-7mol/L IMD1-53后，與10-6mol/L ALD組比較，羥脯氨酸含量呈濃度依賴性下降(Plt;0.01，Plt;0.05)，見圖2。結果顯示，IMD1-53呈濃度依賴性地抑制ALD誘導CFBs膠原蛋白合成。

3ALD對CFBs的ERK磷酸化激活的影響

ALD作用CFBs 5 min、10 min和30 min時與對照組比較p-ERK蛋白表達均有顯著差異(Plt;0.01)。且在10 min時達最高值，見圖3。結果顯示，ALD對CFBs的ERK磷酸化激活在10 min之內逐漸增強，之后又逐漸下降。

4IMD1-53對ALD誘導CFBs的p-ERK蛋白表達的作用

ALD組的p-ERK蛋白表達量與對照組比較明顯升高(Plt;0.05)，ALD+IMD組蛋白表達量與ALD比較明顯降低 (Plt;0.05),見圖4。結果顯示，IMD1-53明顯抑制ALD誘導CFBs的p-ERK蛋白的表達。

Figure 2. Effect of IMD1-53 on ALD-induced collagen synthesis in cultured CFBs. Intracellular collagen level was measured by measuring hydroxyproline in the supernatants. ±s.n=3.**Plt;0.01 vs control(without treatment);#Plt;0.05,##Plt;0.01 vs ALD (10-6 mol/L) alone.

Figure 3. Expression of p-ERK protein in rat CFBs±s.n=3.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs control.

Figure 4. Expression of p-ERK protein in rat CFBs±s.n=3.**Plt;0.01 vs A group；#Plt;0.05 vs B group.

討 論

心肌重構(包括心肌細胞和細胞外基質重構)是心力衰竭的主要病理基礎，心肌損傷后，大量細胞因子參與了修復重構過程[5，6]，而心肌纖維化是心肌重構的重要形成原因[7]。隨著我國冠心病、心肌梗死、高血壓等發病率的上升，心肌肥厚以及心肌間質纖維化的發生也在增多，因此阻止或逆轉纖維化是延緩心力衰竭，減少心律失常發生的重要手段。

已有的研究發現IMD具有明顯舒張血管、降低血壓、加快心率作用[8]；對缺血/再灌注誘導的心肌細胞凋亡具有保護作用[9]；具有調節新生大鼠肥大心肌細胞的作用[10]；對離體大鼠的心臟具有正性肌力和增加冠脈流量的作用[4]；對腎性高血壓大鼠[11]和腎衰竭大鼠[12]也具有調節作用。Smith等[13]發現IMD通過ERK、Akt/NOS/NO及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)信號通路促進血管內皮生長。Albertin等[14]發現IMD不僅可通過降鈣素受體樣受體/受體活性修飾蛋白(calcitonin receptor-like receptor/receptor activity-modifying proteins,CLR/RAMPs)誘導血管內皮生長因子釋放，而且還可通過反式激活血管內皮生長因子受體系統來誘導人體血管內皮細胞的促血管生成反應。

本實驗結果顯示，ALD明顯刺激細胞增殖，IMD1-53對基礎狀態下的CFBs無明顯抑制作用。在ALD作用的情況下，IMD1-53呈濃度依賴性抑制ALD刺激的CFBs增殖，提示IMD1-53可作為心肌纖維化的抑制因子，以對抗心肌纖維化形成過程中刺激因子的作用，且具有濃度依賴效應。

ERK通路是MAPK途徑中最經典、研究最透徹的通路，該通路是多種促增殖信號轉導途徑的節點和共同通路。在本實驗中IMD1-53改善了ALD誘導的CFBs增殖和膠原合成，但IMD1-53的這種作用是通過何種信號轉導機制目前尚不清楚。本實驗結果表明在ALD刺激下，CFBs中p-ERK的表達明顯高于對照組，且在ALD作用10 min時p-ERK表達最強，而CFBs中ERK的表達未見變化。提示ALD誘導的CFBs增殖是通過ERK的磷酸化而實現的。在以10-7mol/L IMD濃度預先干預下，再加入ALD共同作用后，p-ERK的表達呈下降趨勢；而ERK的表達在各組中均未見變化，由此可知抑制ERK的磷酸化是IMD抑制ALD誘導的CFBs增殖和膠原合成的信號通路之一，即是逆轉心肌纖維化的分子生物學機制。IMD在血管內皮細胞中可誘導細胞遷移和血管形成，這些作用又可通過抑制ERK等信號通路而被阻止[13]。總之這些結果顯示IMD可以通過抑制ERK的磷酸化來抑制心肌成纖維細胞增殖，而在血管內皮細胞中IMD可通過ERK信號通路加強血管再生。

綜上所述，IMD1-53可呈濃度依賴性地抑制ALD誘導的CFBs的增殖，IMD1-53可以通過下調p-ERK表達抑制ALD誘導的CFBs增殖，從而減緩心肌纖維化。

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成年小鼠海馬齒狀回存在有別于室管膜區神經干細胞的定向祖細胞種群

目前關于在成年哺乳動物海馬區是否存在神經干細胞仍存在爭論。同源細胞集落形成測定可觀察單細胞發展成具有干細胞自我更新功能和多潛能的細胞的過程。在體外實驗中，加拿大科學家發現來自成年小鼠側腦室室管膜下區(SEZ)的單細胞可形成大量具有自我更新與多潛能的細胞集落，但來自成年小鼠海馬區齒狀回(DG)的單細胞則產生較少、無自我更新能力及僅單向發展的集落。在DG結構形成之前，能分離到具有長期自我更新與多潛能的集落的區域僅存在于早期胚胎的海馬。未見祖細胞從后生的SEZ向新形成的DG亞粒狀區域移動。體外實驗中成熟的DG集落來源于胚胎期的海馬原基。有關胚胎海馬區神經干細胞隨著器官年齡增加而發生特性改變這一模型也得到實驗的證實。當用成年小鼠DG 球狀體細胞與胚胎腦組織切片共同培養，可使DG 球狀體細胞的自我更新功能(而不是多潛能的功能)得以恢復，該功能在撤除共培養的胚胎腦組織切片后仍能維持數代。用成年小鼠克隆的DG 球狀體細胞種植于胚胎腦組織切片或移植入新生鼠腦內不會產生神經元，培養分離的小集落產生的神經元比體外實驗中用球狀體集落產生的神經元的數量大約多十倍，可能是在成年小鼠體內有維持神經發生功能的緣故。同時，在用微解剖和單細胞培養的體外實驗中，DG神經前體細胞從胚胎到成年的集落形成測定發現，DG集落逐漸失去多潛能及自我更新能力，直至成年神經膠質細胞出現，即DG神經前體細胞不是神經干細胞，有別于室管膜下區(SEZ)的神經干細胞。作者推測成年小鼠海馬區分別存神經膠質集落與神經元集落，在觀察成年海馬區神經膠質細胞的增殖時應將神經膠質集落與神經元集落分開培養。

Stem Cells, 2011, 29(9):1448-1458(李學敏)

Effectofintermedin1-53onaldosterone-inducedcardiacfibroblastproliferation

XUE Li-hua1, LIANG Ying1, SONG Jun-qiu2, QI Yong-fen2, JIA Yue-xia1

(1DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences，NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China;2DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100083,China.E-mail:jiayuexia@163.com)

AIM: To investigate the roles of intermedin1-53(IMD1-53) and exteracellular signal-regulated kinase (ERK) signal pathway in the proliferation of rat cardiac fibroblasts (CFBs).METHODSIsolated and cultured CFBs from new born SD rats were randomly divided into control group, aldosterone (ALD) groups (at different concentrations) and ALD+IMD groups (IMD at different concentrations). The viability of CFBs was determined by MTT assay. Western blotting was used to observe the effect of IMD on ALD-induced ERK phosphorylation.RESULTSIMD1-53had no significant effect on the proliferation of CFBs in basal state, but inhibited the CFBs growth stimulated by ALD in a concentration (10-9～10-7mol/L)-dependent manner. IMD1-53also inhibited ERK phosphorylation stimulated by ALD in a concentration (10-9～10-7mol/L)-dependent manner.CONCLUSIONIMD1-53inhibits the proliferation of CFBs by ERK signal pathway.

Intermedin1-53; Cardiac fibroblast; Aldosterone; ERK pathway

1000-4718(2011)11-2056-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.002

2010-12-17

2011-09-13

國家自然科學基金資助項目 (No. 30860372)

△通訊作者 Tel:0951-6980093; E - mail: jiayuexia@163. com