膽道外引流對大鼠肝再生的影響及其細胞周期調控機制

陳 東， 周 奇， 梁力建， 殷曉煜， 彭寶崗， 李紹強， 黃 力， 黃潔夫

(中山大學附屬第一醫院肝膽外科，廣東 廣州 510080)

膽道外引流對大鼠肝再生的影響及其細胞周期調控機制

陳 東， 周 奇， 梁力建△， 殷曉煜， 彭寶崗， 李紹強， 黃 力， 黃潔夫

(中山大學附屬第一醫院肝膽外科，廣東 廣州 510080)

目的觀察膽道外引流(ED)對大鼠肝再生及肝細胞周期的影響。方法采用大鼠70%肝切除模型，SD大鼠隨機分成6組，每組8只，分別為正常切肝24 h組、48 h組，阻塞性黃疸(OJ)切肝24 h組、48 h組，OJ后ED 3 d切肝24 h組、48 h組。采用增殖細胞核抗原(PCNA)標記和Feulgen染色測定肝再生能力；采用RT-PCR 測定肝組織肝細胞生長因子(HGF)、p27和cyclin D1 mRNA水平變化；免疫組化法測定HGF、轉化生長因子β1(TGF-β1)和p21在肝細胞的表達。結果OJ切肝后PCNA標記指數較對照組低(Plt;0.05)，ED后PCNA標記指數更低，與OJ組對比差異顯著(Plt;0.05)。DNA含量變化與PCNA標記指數相似。與正常切肝組比較，OJ后切肝組HGF mRNA下降(Plt;0.05)，ED后切肝組進一步下降并較OJ組低(Plt;0.05)。與正常組相比，OJ后切肝24 h和48 h cyclin D1 mRNA均下降(Plt;0.05，Plt;0.01)，ED后切肝組進一步下降，但差異不顯著。與正常切肝組相比，48 h時OJ后切肝組高于正常切肝組(Plt;0.05)，ED后p27 mRNA水平較OJ進一步升高(Plt;0.05)。與正常切肝組比較，OJ后切肝組肝細胞HGF表達在24 h下降(Plt;0.05)，ED后切肝組進一步下降并較OJ組低(Plt;0.05)。p21表達各組間無顯著差異。與正常切肝組相比，24 h時OJ后切肝組TGF-β1表達上調，差異顯著(Plt;0.05)，ED后切肝組上調，但差異不顯著。結論OJ可造成大鼠肝再生能力下降，ED后其肝再生能力進一步降低。ED后肝再生能力下降可能和HGF、p27密切相關，與TGF-β1、p21、cyclin D1無關。

黃疸，阻塞性； 膽道引流； 肝再生； 細胞周期

多數以70%肝切除大鼠模型的研究發現阻塞性黃疸后大鼠肝再生能力較正常下降，亦有促進肝再生的報道；多數動物實驗認為術前膽道外引流(external drainage, ED)抑制肝切除后肝再生，亦有實驗證實術前膽道引流對肝切除后肝再生無影響[1,2]，目前尚未有統一的結論；另外，目前尚缺乏阻塞性黃疸(obstructive jaundice, OJ)膽道引流后肝再生、肝細胞周期變化的研究。本研究旨在探討阻塞性黃疸及膽道外引流后大鼠肝切除后肝再生能力變化及其肝細胞周期調控的機制。

材 料 和 方 法

1材料

純系清潔級SD大鼠，雄性，體重250～320 g，中山大學實驗動物中心提供。動物在中山大學附屬第一醫院動物實驗中心清潔級動物實驗室飼養，飼料由中山大學實驗動物中心提供。人體醫用硅膠管(內徑1.0 mm，外徑1.2 mm，上海精化醫用橡膠廠)，逆轉錄試劑盒(Toyobo)，Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，引物由上海生物工程研究所合成，兔抗鼠抗體p21(Santa Cruz，工作濃度1∶100)，兔抗鼠抗體肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)(Santa Cruz，工作濃度1∶200)，兔抗鼠抗體轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)(博士德生物工程公司，工作濃度1∶100)，免疫組化試劑盒(博士德生物工程公司)，PCNA檢測試劑盒(博士德生物工程公司)，無色品紅試劑，0.5%偏重亞硫酸鈉水溶液，0.2%亮綠水溶液(亮綠0.2 g，蒸餾水100 mL溶解)，5 mol/L鹽酸水溶液(比重1.19的濃鹽酸42 mL，加至蒸餾水100 mL中溶解)，火棉膠液(火棉膠0.5 g，無水乙醇50 mL，乙醚50 mL)，Kontron IBAS 2.5 全自動圖像分析系統，Beckman DU640紫外分光光度計,PE480基因擴增聚合酶鏈式反應系統(PE)，SK-100型凝膠紫外分析儀，IBAS(Interactive Build Analysis System)圖像處理系統(Carl Zeiss)。

2方法

2.1實驗分組 實驗動物隨機分為6組，每組8只，分別為A組：正常切肝24 h處死組：正常大鼠切除70%肝臟，24 h后處死；B組：正常切肝48 h處死組，同A組切肝48 h后處死；C組：OJ 7 d切肝24 h處死組，采用經典OJ模型，OJ 7 d后切除70%肝臟，24 h后處死；D組：OJ 7 d切肝48 h處死組，同C組切肝48 h后處死；E組：ED 3 d切肝24 h處死組，采用改進OJ模型，OJ 7 d后開放末端結扎形成膽道外引流，3 d后切除70%肝臟，24 h后處死；F組：ED 3 d切肝48 h處死組，同E組切肝48 h后處死。各組大鼠處死前1 d禁食不禁水，清晨處死動物，切取約1.5 g肝組織10%甲醛固定，石蠟包埋后待檢，在肝右葉同一部位切除1.5 g肝組織，迅速放入液氮罐中，24 h后轉入-80 ℃備測。

2.2手術方法

① 經典OJ模型 大鼠術前1 d放入鼠籠中適應環境并禁食，可飲水。術前稱體重，水合氯醛麻醉后大鼠仰臥固定，碘酒、乙醇消毒腹部，上腹正中切口開腹，找到膽總管(common blie duct，CBD)，距離左、右肝管匯合處以下0.5 cm結扎CBD，雙重結扎，中間離斷造成OJ模型，關腹。

② 改進OJ模型和ED方法[3]膽總管置入硅膠管，插入CBD置距離左、右肝管匯合處約0.2 cm，插入至少0.5 cm，雙重5-0絲線結扎固定，膽總管另一端結扎關閉。將插入的硅膠管小心引出體外，肌肉處、引出腹壁處均妥善固定好，通過皮下隧道引出至大鼠頸部背側皮下固定，末端用線扎緊，埋入皮下。造成ED時，從皮下取出硅膠管開放，外接橡膠手套制成的引流袋，妥善結扎固定。

③ 70%肝切除(partial hepatectomy) 術前30 min腹腔注射阿托品0.03～0.05 mg，乙醚麻醉后大鼠仰臥固定，碘酒、75%乙醇消毒腹部切口，從原切口開腹，參照Higginst等[4]法切除大鼠左側葉與中葉(用5-0線結扎、切斷肝臟)，ED組肝切除后將原膽道置管剪斷，留約2～3 cm，十二指腸壁荷包縫合，戳洞后將管消毒并置入十二指腸，切面止血后關腹。分籠喂養，燈下過夜。

2.3Feulgen染色測DNA含量 切片脫蠟至水，入5 mol/L鹽酸于室溫下水解40 min，直接轉入無色品紅液，于室溫下置暗處作用60～90 min，不經水洗，直接滴入0.5%偏重亞硫酸鈉水溶液洗2次，每次1 min，流水洗5 min；0.2%亮綠水溶液復染40 s，水洗30 min，常規脫水透明，中性樹膠封固。DNA呈紫紅色，胞質和其它組織成分綠色。采用Kontron IBAS 2.5 全自動圖像分析系統，在200倍視野下每張玻片隨機選取3個視野，測定每個視野的陽性反應物的灰度Gα及面積Aα，選定區域的平均面積A及平均灰度GA，將圖像轉化為量化單位，用“陽性單位(positive unit, PU)”表示，參照文獻介紹的公式計算PU[5]。PU=[| Gα- GA|/(1-AAα)×Gmax] ×100，AAα為陽性反應物的面積密度，AAα= Aα/A。Gmax為儀器的最大灰度。PU值越大，表示DNA相對含量越高。

2.4逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測HGF、cyclin D1和p27 mRNA 用oligo軟件輔助設計引物，引物序列見表1。PCR反應參考TaKaRa Ex Taq(DRR100A)說明書進行，各基因退火溫度見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

2.5免疫組化染色檢測增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、HGF、TGF-β1和p21 將所有標本連續切片6張，厚度4 μm，收取組織后切片置入恒溫箱60 ℃下烤片1 h，使組織在玻片上充分展開并緊密黏附。PCNA檢測參照試劑盒說明書進行，HGF、TGF-β1和p21檢測采用免疫組化SABC法，試驗步驟按免疫組織化學SABC試劑盒說明書進行。

PCNA參照文獻[6]以核表達為陽性表達細胞，隨機選取5個高倍視野(×400)，每個視野計數500個細胞，計算陽性細胞平均數，換算成百分比，為PCNA標記指數(labeling index, LI)。HGF的表達以胞漿表達為陽性表達細胞，TGF-β1的表達以胞漿表達為陽性表達細胞，p21表達以核表達為陽性表達細胞，隨機選取5個高倍視野(×400)，每個視野計數200個肝細胞，計算陽性細胞平均數，換算成百分比，分別為HGF 、TGF-β1、p21標記指數。

3統計學處理

結 果

1肝組織PCNA和DNA含量(Feulgen染色)的變化

70%肝切除后各組的PCNA表達變化為，對照組切肝24 h及48 h后PCNA LI均下降，48 h較24 h為低。OJ切肝后PCNA LI較對照組低(Plt;0.05)，ED后PCNA LI更低，與OJ組對比差異顯著(Plt;0.05)。DNA含量變化與PCNA LI相似，見圖1。

Figure 1. Statistical results of PCNA LI(A) and DNA content(B) after 70% partial hepatectomy in different groups±s.n=8,*Plt;0.05 vs control; #Plt;0.05 vs OJ group.

經相關分析，PCNA LI和Feulgen染色PU值兩者呈正相關關系(r=0.458，Plt;0.05)。

2大鼠肝組織HGF、cyclinD1和p27mRNA水平的變化

與正常切肝組比較，OJ后切肝組HGF mRNA在24 h下降(Plt;0.05)，ED后切肝組進一步下降并較OJ組低(Plt;0.05)，48 h變化類似。與正常組相比，OJ后切肝組cyclin D1 mRNA在24 h下降(Plt;0.05)，ED后切肝組進一步下降，但差異不顯著，48 h時OJ后切肝組cyclin D1 mRNA與正常組相比亦下降(Plt;0.01)，ED后切肝組與OJ后切肝組相比亦下降，但無顯著差異。與正常切肝組相比，OJ后切肝組p27 mRNA水平上調，但表達無差異，ED后切肝組上調，與OJ后切肝組相比差異顯著(Plt;0.01)，48 h時OJ后切肝組高于正常切肝組(Plt;0.05)，ED后p27 mRNA水平較OJ進一步升高(Plt;0.05)，見圖2、3。

3大鼠肝細胞HGF、p21和TGF-β1表達的變化

與正常切肝組比較，OJ后切肝組肝細胞HGF表達在24 h下降(Plt;0.05)，ED后切肝組進一步下降并較OJ組低(Plt;0.05)，48 h變化類似但ED后切肝組較OJ后切肝組下降無顯著差異。p21表達在各組處于一個較低的相似的水平，見圖4，各組間無顯著差異。與正常切肝組相比，24 h時OJ后切肝組TGF-β1表達上調，差異顯著(Plt;0.05)，ED后切肝組上調，但差異不顯著，48 h OJ后切肝組和ED后切肝組變化類似，見圖5。

討 論

1膽道外引流對OJ大鼠肝再生的影響

本研究發現正常大鼠切除70%肝臟后24 h PCNA LI在較高水平，48 h下降，提示正常大鼠切肝后肝再生24 h達到峰值，48 h后下降；OJ大鼠切肝后24 h、48 h的PCNA LI與正常組相比顯著降低，DNA含量存在同樣的變化，顯示阻塞性黃疸降低了大鼠肝切除后肝再生的能力。Ueda等[6]以PCNA作為指標得出相似的結果。本研究ED切肝后PCNA LI進一步降低，與OJ切肝組對比差異顯著，顯示與正常大鼠切肝相比，ED后大鼠肝再生能力進一步下降，提示ED并不能改善肝再生，反而起抑制肝再生的作用。Saiki等[7]在70%肝切除大鼠模型上利用DNA合成率作為肝再生指標，證明阻塞性黃疸后大鼠肝再生能力下降，膽道外引流后切肝大鼠的肝再生能力進一步下降，且內引流可以使大鼠肝再生能力增強，認為在改善肝再生能力上內引流的作用要優于外引流。這個過程可能和膽汁的流失有關。膽汁酸是膽汁的主要成分，Barone等[8]利用大鼠肝切除模型，證實進食富含膽汁酸成分食物的大鼠肝再生能力較禁食普通食物大鼠強；而當膽汁酸大量流失后，由于代償作用肝臟大量合成膽汁酸使肝合成膽固醇的能力下降，而腸道內膽汁缺乏造成膽固醇合成進一步下降，膽固醇屬于對于肝切除后肝再生有用的物質；對正常大鼠肝臟膽道外引流7 d后肝再生能力亦下降，這可能由于膽汁內含對肝再生有重要作用的物質[6]。目前對于膽汁成分對肝臟的作用研究甚少，還不明確究竟是膽汁中的何種成分、通過何種機制發揮加強肝再生的作用。

2膽道外引流對OJ大鼠肝再生的細胞周期調控機制

與正常切肝組相比，OJ組HGF和cyclin D1 mRNA在24 h和48 h均較低，提示阻塞性黃疸后肝再生能力下降可能與HGF和cycliln D1 mRNA轉錄水平的變化相關。這個結果提示，對于肝再生來說，HGF是非常重要的一個因子。Makino等[9]發現大鼠OJ切肝后HGF mRNA的達峰期較正常對照組延遲，正常對照組切肝后12 h HGF mRNA達峰，而OJ后切肝達峰時間延遲到72 h；同時單純阻塞性黃疸可使HGF mRNA水平升高，同時PCNA LI升高。本研究亦發現cyclin D1 mRNA在正常對照組48 h較24 h高，而OJ組48 h雖亦有上升，但差異不顯著。ED切肝后大鼠HGF mRNA水平進一步下降，而cyclin D1 mRNA變化不大，提示ED導致OJ大鼠肝再生能力進一步下降可能和HGF關系較密切，而與cyclin D1無關。Cyclin D1由多種途徑可以調節，Nakano等[10]證實，內引流改善OJ大鼠肝再生能力的過程與cyclin D1無關，而可能和CCCAT/enhanced binding protein(C/EBP)-α、cycliln E途徑相關。外引流抑制OJ大鼠肝再生能力的過程可能與此類似，也與cyclin D1無關。

Figure 3. Quantitative analysis of HGF(A), cyclin D1(B) and p27(C) mRNA expression after 70% partial hepatectomy in different groups±s.n=8.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs conrol;#Plt;0.05，##Plt;0.01 vs OJ group.

切肝24 h，OJ組和對照組p27 mRNA水平表達無差異，48 h OJ組顯著高于對照組；ED切肝后p27mRNA水平較OJ進一步升高，24 h、48 h均具有顯著差異(Plt;0.05，Plt;0.01)。這個結果提示p27可能參與OJ大鼠肝再生抑制的細胞調控機制；ED后OJ大鼠肝再生進一步抑制的機制可能和p27存在較大關系。Ueda等[6]發現內引流后阻黃大鼠肝再生改善，而外引流肝再生抑制機制與cyclin E相關激酶活性上升有關。p27和cyclin E關系密切，與p21相比，p27對肝再生的作用可能更具影響。比較p21、p27基因敲除對肝再生的影響，發現小鼠肝細胞數目的增長只和p27基因敲除相關；另外從p27基因敲除小鼠分離出肝細胞，發現其具有強大的再生、增殖能力，且機制與cyclin E相關激酶的活性變化相關[11]。

Figure 4. Immunohistochemical staining of p21 after OJ and partial hepatectomy (×200). Low level expression of p21 in hepatocytes was observed.

Figure 5. Quantitative analysis of HGF(A)，TGF-β1(B) and p21(C) protein expression detected by immunohistochemical staining after 70% partial hepatectomy in different groups±s.n=8.*Plt;0.05 vs control; #Plt;0.05 vs OJ group.

本實驗發現，OJ切肝后24 h、48 h TGF-β1表達上升，較正常對照組有顯著差異，這個結果和Makino等[9]的研究相似，因此其認為阻塞性黃疸后肝再生降低主要是HGF延遲到達峰值和TGF-β1高表達的緣故。TGF-β1一般被認為是肝再生的負性調節因子，細胞培養實驗證明，TGF-β1可以抑制肝細胞的再生；OJ大鼠注射TGF-β1可以使OJ大鼠肝切除后降低的肝再生能力恢復，同時肝功能指標得到改善[12]，提示TGF-β1是阻塞性黃疸肝再生抑制過程中的另外一個重要的因子。本實驗結果提示ED切肝后TGF-β1與OJ組相比無顯著差異，提示在外引流抑制肝再生的細胞周期調控機制中TGF-β1不起主要作用。

p21表達在各組相似，提示p21不參與阻塞性黃疸和外引流導致肝再生變化的機制。但Albrecht等[13]利用Western blotting檢測發現，大鼠肝切除后肝再生的過程中p21下降，但他的實驗是分離肝切除后大鼠的肝細胞，且與阻塞性黃疸過程無關。

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Effectofexternalbiliarydrainageonliverregenerationandregulatorymechanismofcellcycleinrats

CHEN Dong,ZHOU Qi, LIANG Li-jian, YIN Xiao-yu, PENG Bao-gang, LI Shao-qiang, HUANG Li, HUANG Jie-fu

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:lianglj@medmail.com.cn)

AIM: To investigate the effect of external biliary drainage on the liver regeneration and the regulatory mechanism of cell cycle in rats.METHODSThe SD rats were used to establish the model of 70% partial hepatectomy (PH). The rats were divided into 6 groups, including normal rats with PH for 24 h or 48 h, obstructive jaundice (OJ) rats with PH for 24 h or 48 h and external drainage (ED) rats with PH for 24 h or 48 h. PCNA labeling index (LI) and DNA content (Feulgen staining, PU value) were measured. The mRNA expression of hepatocyte growth factor(HGF), p27 and cyclin D1 was detected by RT-PCR. The protein levels of p21, HGF and transforming growth factor β1(TGF-β1) in hepatocytes were determined by the method of immunohistochemistry.RESULTSThe PCNA LI in OJ rats after PH was lower than that in control groups (Plt;0.05) and was further lower in ED groups compared with OJ groups (Plt;0.05). The PU value of Feulgen staining was positively correlated with PCNA LI. The mRNA level of HGF in OJ rats was significantly lower (Plt;0.05) than that in control groups, and further lower in ED groups (Plt;0.05) than that in OJ groups. Compared with control groups, the mRNA level of cyclin D1 was lower at 24 h and 48 h (Plt;0.05,Plt;0.01) in OJ rats, and was further lower after ED, but the changes were not statistically significant. Compared with control group, the changes of p27 mRNA was significantly higher at 48 h (Plt;0.05) in OJ rats and even higher after ED (Plt;0.05). The expression of HGF in OJ rats was lower at 24 h (Plt;0.05) compared with control group, and was further lower (Plt;0.05) after ED compared with OJ group. The expression of TGF-β1was increased in OJ rats compared with control groups (Plt;0.05) and further increased after ED, but there was no statistical significance between OJ groups and ED groups. No difference of p21 expression among groups was observed.CONCLUSIONLiver regeneration is inhibited by OJ and further impaired after ED. The inhibition of Liver regeneration is associated with HGF and p27, but not with TGF-β1, p21 and cyclin D1.

Jaundice,obstructive; Biliary drainage; Liver regeneration; Cell cycle

1000-4718(2011)11-2199-06

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.031

2011-04-11

2011-09-28

△通訊作者 Tel:020-87755766-8214; E-mail:lianglj@medmail.com.cn