ERK5基因-322G/T多態性與散發性結直腸癌易感性的關系

鮮振宇， 王 磊， 任東林， 陳典克， 刁德昌， 宋順心， 黃清華， 汪建平

(中山大學附屬第六醫院胃腸病研究所， 廣東 廣州 510655)

ERK5基因-322G/T多態性與散發性結直腸癌易感性的關系

鮮振宇， 王 磊， 任東林， 陳典克， 刁德昌， 宋順心， 黃清華， 汪建平△

(中山大學附屬第六醫院胃腸病研究所， 廣東 廣州 510655)

目的探討有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路ERK5基因-322G/T(rs3866958)單核苷酸多態性與中國華南地區散發性結直腸癌(CRC)易感性的關系。方法采用Taqman-MGB熒光探針法檢測華南地區835例腸癌和908例正常對照的ERK5基因-322G/T單個核苷酸的多態性。結果ERK5基因單核苷酸多態性位點-322G/T等位基因在結直腸癌患者和健康對照人群中分布差異無統計學意義(Pgt;0.05)，但在BMI≥24 kg/m2的肥胖人群中-322G/T的分布差異顯著，與GG基因型相比，GT、TT基因型攜帶者的CRC發病風險下降42.4%(OR=0.576, 95%CI0.413-0.804，Plt;0.01)。結論ERK5基因-322G/T單核苷酸多態性與結直腸癌發病無明顯相關性，但可顯著降低肥胖患者發病風險;-322T基因型是中國南方人群散發性結直腸癌肥胖患者的獨立保護因素。

結直腸腫瘤； 細胞外信號調節激酶 5； 多態性，單核苷酸

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一。近年來隨著食物結構和生活方式的改變，我國的結直腸癌發病率和死亡率呈逐年上升的趨勢[1],已超越胃癌成為我國第二大癌癥。結直腸癌的發病機制尚未完全闡明，現一般認為其發病是環境因素(飲食習慣、腸道細菌等)與內在因素(基因變異、癌前病變)相互作用的一個復雜而漫長的過程。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)標記(主要指基因組單個核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性)是否會引起基因蛋白表達差異甚至導致疾病日益受到重視。近年來，隨著大量的SNP位點的檢出，其與結直腸癌的發生、發展、化療耐藥性及預后等方面的相關性日益受到關注。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一個多基因家族，能被各種細胞外信號激活[2]。通過MAPK信號通路級聯反應，外部環境信號被傳遞到細胞質及細胞核內，引起細胞合成相應的蛋白從而對外環境的變化作出反應。目前在哺乳動物細胞中已鑒定出4條MAPK信號轉導通路：細胞外信號調節激酶 1/2(extracellular signal- regulated kinase1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、 p38 MAPK和細胞外信號調節激酶5 (extracellular signal-regulated kinase，ERK5)。ERK5是其中最新的一條通路，是MAPK家族的重要組成部分。國外已有文獻報道ERK5通路與乳腺癌、肝癌、肺癌及前列腺癌、良性前列腺增生癥等疾病的相關性，但尚未有ERK5基因 SNP與結直腸癌關聯性的報道。所以本研究擬采用 Taqman -MGB熒光探針法首次探討ERK5基因-322G/T單核苷酸多態性位點與結直腸癌的相關性。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要儀器與試劑 ABI7500實時定量熒光PCR儀(ABI，No. 275004365)；ABI 3730 DNA測序儀(ABI)。Taqman Universal PCR Master Mix(ABI)；血液基因組抽提試劑盒(北京天根生化科技公司)；1×TE緩沖液(1 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA,pH 8.0)；測序引物由上海Invitrogen合成；2×GoTaq Master Mix (Promega)；PCR引物純化試劑盒(Promega)。

1.2病人資料 病例組選自2002年7月-2010年2月在廣州6個臨床中心就診的835例結直腸癌患者，均經組織病理學確診，病例組對象納入標準包括：華南地區漢族人群，無血緣關系。剔除標準為家族性腺瘤性息肉病和遺傳性非息肉性結直腸癌。對照組為同時期同一地區無血緣關系的健康體檢人群，均為漢族，共908例，對照組與病例組按年齡(±5歲)和性別上相匹配。所有參與實驗者均簽署知情同意書，并獲中山大學附屬第六醫院倫理委員會批準。

2方法

2.1基因組DNA提取 按常規蛋白酶K消化、苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀法提取外周血白細胞基因組DNA，pH 8.0 TE溶解，-20 ℃保存。部分DNA按照實驗要求濃度稀釋至10 mg/L,-4 ℃保存備用。

2.2多態性位點的選擇 根據GenBank單核苷酸多態性數據庫(http://www.ncbi. nlm.nih.gov) Hap-map、GenBank提供的數據庫信息，凡亞裔人群中已報道的ERK5等位基因頻率gt;0.05的均可入選。最終我們選擇了-322G/T(rs3866958)作為我們的研究位點。

2.3TaqMan-MGB探針法基因分型 ABI公司7500實時定量熒光PCR儀進行檢測。-322G/T位點等位基因G對應FAM 熒光基團，T對應VIC 熒光基團。FAM 或VIC 熒光明顯上升代表檢測的樣本基因型為其對應基因的純合子，而FAM和VIC熒光同步升則樣本為雜合基因型，見圖1。采用合成引物序列：上游引物5’-GAATGTGTCATCCCCGGTAG-3’,下游引物5’-CCTTTCCTTCCAGCTCACAG-3’ 。每次PCR擴增均設立陰性對照(除未加入DNA模板外，其他加入試劑與待檢測標本相同)。20 μL PCR 反應體系包括:PCR Mix 0 μL,上、游引物及探針Mix 2 μL,DNA模板：1 μL，ROX 0.04 μL，3 d水 7 μL 。PCR反應循環條件(ABI 7500實時熒光PCR儀)：95 ℃預變性10 min，使AmpliTaq Gold? DNA聚合酶活化，然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,55個循環。反應結束由ABI 7500實時熒光PCR等位基因辨別系統對樣本進行分型。分成GG、GT、TT型，結果由2位不知道病例或對照分組情況的實驗者判斷。在實驗時設已知基因型的樣本為陽性對照，并隨機抽取10%的樣本加以驗證，結果100%吻合。

3統計學處理

在被納入本研究以前的時間里吸煙總量達100支者定義為“有”吸煙史，否則為“無”吸煙史。在入組本研究前每周至少飲酒1次、持續時間不少于1年者，定義為“有”飲酒史，反之定義為“無”飲酒史。采用基因計數法計算各多態等位基因頻率和基因型頻率。以擬合優度2檢驗進行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-weinberg equilibrium，HWE)檢驗。病例組和對照組基本信息和基因型分布的比較采用2檢驗。基因多態性與結直腸癌的關聯強度采用校正優勢比(adjusted odds ratio,adjusted,)及其95 %可信區間(95% confidence interval,CI)進行描述。數據采用非條件Logistic回歸模型計算各基因型與結直腸癌風險的相關性。采用相乘模型來判斷基因-環境之間是否存在交互，同時采用似然比檢驗來分析總的交互模型是否有意義。全部統計分析均在SPSS 9.13.0軟件中進行。

Figure 1. The curves of genotypes detected by TaqMan-MGB fluorescence probe methods. A:fluorescent curves of GG genotype;B:fluorescent curves of GT genotype;C:fluorescent curves of TT genotype;D:auto allelic discriminaion by ABI7500 system.

結 果

1研究對象的一般情況

結直腸癌組與健康對照組比較，年齡、性別分布無差異,Pgt;0.05，吸煙、飲酒、癌癥家族史、體重指數分布有明顯差異,Plt;0.05，見表1。

2-322G/T與結直腸癌罹患風險關系

-322 G/T多態性位點基因型在病例組與對照組頻數分布特征見表2。對照組基因型頻率符合哈迪-溫伯格平衡規律(Pgt;0.05)，通過對對照組與病例組各基因型進行統計分析發現各基因型分布無顯著差異(Pgt;0.05)，因此尚不能認為ERK5基因-322G/T(rs3866958)多態性位點與結直腸癌發病存在關聯性。

3-322G/T位點各基因型在肥胖患者中的分布

我們進一步按年齡、性別、吸煙、飲酒、癌癥家族史和體重指數分成亞組，在年齡、性別、吸煙、飲酒和癌癥家族史各亞組中，GG與GT+TT基因型分布無顯著差異(Pgt;0.05)。在以體重指數BMI進行分層分析時，在BMI≥24 kg/m2的肥胖者中，病例組與對照組GG與GT+TT基因型分布差異顯著(Plt;0.01，OR=0.576 ,95%CI0.413-0.804 ) ，見表3。這說明在肥胖者中，ERK5基因-322G/T(rs3866958)多態性與結直腸癌發病可能有關聯。

表1 CRC組與對照組多種混淆因素頻率比較

4-322G/T與BMI的交互作用

我們通過Logistic回歸模型以乘法效應進一步分層分析各基因型與性別、年齡、吸煙、飲酒、BMI、腫瘤家族史等環境暴露因素的交互作用，見表3，發現BMI與 -322 G/T位點基因型存在交互作用(Plt;0.01)。這提示BMI≥24 kg/m2與 -322 G/T位點多態性在促進結直腸癌發生、發展上存在交互作用。

表2 ERK5-322G/T基因型頻數分布與散發性結直腸癌風險的關系

表3 以所選變量分層分析ERK5-322G/T基因型與散發性結直腸癌關系

討 論

結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發生發展機制尚未完全闡明，現一般認為其發病是易感人群受環境的有害因素長期作用的結果，此過程涉及到多步驟、多階段及多基因的改變[3, 4]。

MEK5-ERK5 是MAPK信號通路中最新的一條通路。細胞外的各種刺激因素-應激、高滲透壓、生長因子、絲裂原等可以激活MAPKKK(MEKK3或MEKK2) ,依次激活MAPKK(MEK5) , 然后激活ERK5[5],導致相應蛋白表達的變化，從而引起細胞生長、增殖、分化等生物效應。1995年2個研究團隊[6, 7]分離鑒定出了ERK5蛋白，并證實了MEK5與ERK5之間結合的高度特異性，MEK5是ERK5唯一的上游激酶，即使在MEK5過表達的情況下也不激活MAPK家族其它成員[6, 8]。小鼠ERK5基因由6個外顯子和5個內含子組成，長度5.6 kb，選擇性剪接內含子1和/或2可產生3個亞型：a、b、c,ERK5b和ERK5c均沒有蛋白激酶活性，但可以通過MEF2C蛋白阻斷MEK5和ERK5介導的轉錄活動[9]。人類ERK5基因位于17P11.2,編碼816個氨基酸構成的120 kD蛋白[10]。該蛋白有C端尾巴，長度幾乎是其它MAPK家族成員的2倍，而它的獨特性也就在于它的C端尾巴。研究發現，C端尾巴有自主抑制功能，ERK5通過磷酸化C端尾巴，能自動激活C端尾巴的活性[11]。MEK5-ERK5級聯的作用底物主要為MEF2C(myocyte enhancing factor-2C)[12]，MEF2A和MEF2D也是ERK5的下游作用靶點，但對MEF2B沒有作用。ERK5介導的MEF2A和MEF2D的磷酸化對EGF誘導的c-Jun基因表達起到非常重要的作用[13]。高濃度的PD98059、U0126和PD184352可以起到抑制ERK5 MAPK通路的作用。

現有研究證實，癌基因ras、cot、src等可以激活ERK5,從而影響細胞的生長、增殖等效應[14-16]。在腫瘤細胞中，ERK5的激活可導致一些蛋白激酶受體(如：ErbB家族)表達上調，而與腫瘤預后差、無病生存期短、腫瘤進展及藥物耐受有關。Esparís-Ogando等[7]在對人類腫瘤細胞系中的ERK5進行分析后，發現了呈持續激活狀態的ERK5與活化形式的ErbB2、ErbB3、ErbB4，而在人乳腺癌細胞中，ERK5信號通路可以通過ErbB依賴的機制傳遞加速生長信號。Mehta等[18]通過研究發現MEK5-ERK5級聯與前列腺癌的骨轉移有關。Carvajal-Vergara等[19]發現在多發性骨髓瘤分離細胞中白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)可以激活ERK5，ERK5的顯性負性形式可以限制骨髓瘤細胞的增殖，并使細胞對誘導凋亡的藥物敏感。Hayashi等[20]通過對黑色素瘤的腫瘤血管的發展進行研究后，認為VEGF及FGF介導的腫瘤血管形成均需要ERK5通路的參與。

本實驗首次對ERK5 SNP與CRC的相關性進行了研究，我們通過多中心、大樣本的病例對照研究發現ERK5-322G/T(rs3866958)多態性位點與中國華南地區人群CRC發病風險無明顯相關性。提示在普通人群中，ERK5 -322G/T單獨作用并不能增加CRC的發病風險。從表1可以看出，病例組與對照組在年齡、性別因素的分布上差異無顯著(Pgt;0.05)，而在吸煙、飲酒、癌癥家族史及BMI的分布上差異顯著(Plt;0.05)。這也印證了在普通人群中，吸煙、飲酒、癌癥家族史及肥胖是結直腸癌發病高危因素的結論。我們進一步按年齡、性別、吸煙、飲酒、癌癥家族史和體重指數(BMI)等暴露因素進行分層分析，發現在BMI≥24 kg/m2亞組中，GG與GT+TT基因型分布差異顯著(OR=0.576,95%CI0.413-0.804)，-322G/T與BMI≥24 kg/m2存在交互作用。說明在肥胖患者中，-322G/T單獨作用可明顯降低其發病風險，與GG基因型相比，GT、TT基因型攜帶者的CRC發病風險下降42.4%，-322T是中國南方肥胖人群罹患結直腸癌的保護因素。其可能的解釋為-322T變異基因型影響了ERK5的正常功能，從而使其喪失了促進Erb B等蛋白表達上調的能力，無法促進腫瘤血管形成，失去對癌基因的應答，而肥胖人群存在的胰島素抵抗加強了這些作用，所以該SNP位點可顯著降低肥胖人群的罹患風險。這也可能為我們在肥胖人群(BMI≥24 kg/m2)中防治結直腸癌提供一個新的藥物作用靶點。在其它各亞組分層分析中，各基因型分布無明顯差異，也不存在交互作用，說明在不同年齡段、吸煙、飲酒、家族史等特定人群中，-322G/T多態性并不能降低各亞組特定人群的發病風險，這可能與吸煙、飲酒等有害因素及癌癥家族史背景使得該人群失去了-322G/T的保護作用。

綜上所述，ERK5 MAPK信號通路與腫瘤的發生、進展、轉移及預后密切相關，本試驗研究的-322G/T(rs3866958)位點單核苷酸多態性單獨作用尚不能認為可增加中國南方人群罹患結直腸癌的風險，但在BMI≥24 kg/m2的肥胖人群中，-322G/T單獨作用可明顯降低結直腸癌的發病風險，可能為我們在肥胖人群中防治CRC提供新的治療靶點，但具體作用機制及可能產生的效益需要更進一步深入的研究。本研究由于樣本量不夠大且不是以人群為基礎的研究，可能存在研究對象的選擇偏倚。該位點為何可降低肥胖人群的患病風險，尚需進一步的研究。但本實驗畢竟是關于ERK5 SNP與結直腸癌關系的最早的實驗之一，必將為后來研究者提供一定的參考與借鑒價值。

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AssociationbetweenERK5-322G/Tpolymorphismandgeneticsusceptibilitytosporadiccolorectalcancer

XIAN Zhen-yu, WANG Lei, REN Dong-lin, CHEN Dian-ke, DIAO De-chang, SONG Shun-xin, HUANG Qing-hua, WANG Jian-ping

(InstituteofGastroenterology,TheSixthAffiliatedHospital,SunYet-senUniversity,Guangzhou510655,China.E-mail:wangjpgz@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the correlation between extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) -322G/T polymorphism (rs3866958) and the susceptibility to sporadic colorectal cancer (CRC) in southern Chinese population.METHODSERK5 -322G/T genotypes were determined by Taqman-MGB probes in 835 CRC cases and 908 healthy controls.RESULTSNo significance ofERK5 -322G/T genotype distribution between CRC patients and controls was observed, but -322G/T decreased the susceptibility to CRC in fat people whose BMI was ≥ 24 kg/m2. Compared to GG genotypes, the carriers with GT and TT genotypes had a significant decrease in the risk of CRC(OR=0.576,95%CI0.413-0.804,Plt;0.01).CONCLUSIONERK5 -322G/T polymorphism (rs3866958) has no significant relevance with sporadic CRC susceptibility, but decrease, the risk of CRC in people with fatness. The T variant genotype is an independent protective factor against sporadic CRC of overweight patients in southern Chinese population.

Colorectal neoplasms; Extracellular signal-regulated kinase 5; Polymorphism,single nucleotide

1000-4718(2011)04-0699-06

R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.015

2010-10-08

2011-02-16

△通訊作者 Tel:020-38785499;E-mail:wangjpgz@yahoo.com.cn