甲狀腺功能減退對新生仔鼠心肌肌漿網鈣轉運蛋白表達的影響*

毛姍姍， 趙正言

(浙江大學醫學院附屬兒童醫院兒童保健科，浙江 杭州 310003)

甲狀腺功能減退對新生仔鼠心肌肌漿網鈣轉運蛋白表達的影響*

毛姍姍， 趙正言△

(浙江大學醫學院附屬兒童醫院兒童保健科，浙江 杭州 310003)

目的探討甲狀腺功能減退(甲減)對新生仔鼠心肌肌漿網鈣轉運蛋白肌漿網Ca2+-ATP酶(SERCA2a)、磷酸受納蛋白(PLB) mRNA表達以及肌漿網Ca2+-ATP酶活性的影響，并觀察左旋甲狀腺素(L-T4)替代治療后以上指標的改變。方法SD孕鼠自孕15 d起每天予丙基硫氧嘧啶(PTU)(50mg/d)灌胃至仔鼠出生并持續整個哺乳期，制成圍生期甲減模型，并對部分甲減仔鼠自出生當天起每天腹腔注射L-T4(20 μg /kg)。收集甲減、治療及對照組出生3、5、7日齡的仔鼠心室肌組織(每組10只)，應用實時熒光定量PCR方法檢測SERCA2a及PLB mRNA含量，并同時采用熒光分光光度計法測定心肌細胞內游離鈣(MyoCa2+)濃度，無機磷酸根法檢測心肌肌漿網鈣泵活性。結果實時熒光定量PCR結果顯示甲減組新生仔鼠心肌SERCA2a mRNA水平下降(Plt;0.05)，PLB mRNA水平升高(Plt;0.01)，SERCA2a/PLB下降(Plt;0.01);L-T4治療組仔鼠SERCA2a mRNA水平較甲減組上升(Plt;0.05)，PLB mRNA水平下降(Plt;0.05)，SERCA2a/PLB上升(Plt;0.01)。心肌細胞內游離鈣濃度檢測結果顯示甲減組心肌細胞MyoCa2+濃度較同日齡對照組升高(Plt;0.01);L-T4治療組仔鼠心肌細胞MyoCa2+濃度低于同日齡甲減組仔鼠(Plt;0.05)。酶活性檢測結果顯示甲減組仔鼠肌漿網Ca2+-ATP酶活性低于同日齡對照組(Plt;0.01);L-T4治療組仔鼠肌漿網Ca2+-ATP酶活性較同日齡甲減組仔鼠升高(Plt;0.05)。結論甲狀腺激素缺乏可使新生大鼠肌漿網Ca2+-ATP酶活性降低，并下調SERCA2a表達，上調PLB表達；肌漿網鈣轉運蛋白SERCA2a與PLB參與調控圍生期甲減誘發的新生仔鼠心功能下降。

甲狀腺功能減退癥； 肌漿網Ca2+-ATP酶； 磷酸受納蛋白； 大鼠，新生

先天性甲狀腺功能減退癥(congenital hypothyroidism，CH)是兒科較常見的一種內分泌疾病，由于其圍生期甲狀腺激素減少，可對出生患兒的生長和智力發育造成嚴重影響[1]，除了主要對大腦造成嚴重損傷之外，近年來CH對心臟器官的影響倍受關注，我們前期的研究已證實CH對新生兒就可造成心臟收縮和舒張功能損傷，經過早期甲狀腺素替代治療可得到逆轉[2]，但其可能機制尚未明確。肌漿網Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a，SERCA2a)是肌漿網(sarcoplasmic reticulum，SR)膜上重要的Ca2+轉運蛋白，對心肌細胞收縮期和舒張期Ca2+濃度調節均發揮著十分重要的作用[3-5]。磷酸受納蛋白(phospholamban，PLB)是存在于肌漿網中的內源性抑制物，通過蛋白激酶磷酸化反應調節SERCA2a對Ca2+的親和力[6-8]，SERCA2a與PLB之間的定量變化是調節心臟收縮和舒張功能改變的一個重要因素[9]。本實驗通過建立圍生期甲減及甲狀腺素替代治療仔鼠模型，應用實時熒光定量PCR(real-time PCR)方法從mRNA水平定量分析鈣轉運蛋白SERCA2a及PLB含量的變化，同時采用熒光分光光度計法測定心肌細胞內游離鈣(calcium in myocardium，MyoCa2+)濃度，無機磷酸根法檢測各組新生仔鼠的肌漿網Ca2+-ATP酶活性，以觀察仔鼠鈣轉運蛋白基因及表型的變化，探討圍生期甲減誘發新生仔鼠心功能下降的可能機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實驗動物與主要試劑 清潔級SD懷孕大鼠(浙江省醫學科學院實驗動物中心)；丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)(南通精華制藥有限公司)；左旋甲狀腺素(levothyroxine，L-T4)(Sigma)；游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine，FT4)及促甲狀腺激素(thyrotropin，TSH)試劑盒(DPC)；考馬斯亮藍蛋白試劑盒、ATP酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Trizol、AMV 逆轉錄酶(RTase)、Taq酶(上海生工生物工程技術服務有限公司)；引物合成(Invitrogen)。

2方法

2.1動物模型的制備和分組 清潔級SD孕鼠自孕15 d起予PTU(50 mg/d)灌胃至仔鼠出生并持續整個哺乳期，出生仔鼠為甲減鼠。部分甲減仔鼠自出生當日起每日予以腹腔注射L-T4(20 μg /kg)，為L-T4治療組。其余孕鼠每天予生理鹽水灌胃，出生仔鼠為對照組。取3、5、7日齡仔鼠各10只，稱體重(body weight，BW)后斷頭處死，并立即開胸取出心臟置于冰生理鹽水中，剪去心房、腱索及脂肪組織，并洗凈血液，濾紙吸干水分，稱心室凈重量(heart weight，HW)后立即至液氮中凍存。

2.2血清甲狀腺激素水平測定 分離各組仔鼠血清，采用天津德普(diagnostic products corporation，DPC)生物技術和醫學產品有限公司生產的IMMULITE全自動化學發光免疫分析儀及配套試劑盒測定血清FT3、FT4和TSH水平。

2.3實時熒光定量PCR法

① 總RNA提取與cDNA合成 取30 mg左右心肌組織采用Trizol一步法提取總RNA，采用Du-640紫外分光光度儀檢測RNA純度及濃度。取RNA模板5 μL，利用AMV RTase逆轉錄生成cDNA，總反應體系為20 μL。RNA模板5 μL，Oligo-dT(0.165 g/L)3 μL，加RNase-free雙蒸水定容至11.5 μL，輕輕混勻后離心3-5 s；混合物70 ℃反應5 min，冰浴30 s(0 ℃)，離心3-5 s；分別加入5×Buffer 4 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，混勻后離心3-5 s；37 ℃反應5 min；加入AMV RTase2 μL，終體積為20 μL，37 ℃反應60 min，94 ℃反應5 min，結束反應，置于-20 ℃保存。

② 實時熒光定量PCR反應 檢索基因文庫大鼠SERCA2a及PLB序列，參考相關文獻設計引物序列，引物由上海Invitrogen合成。SERCA2a序列上游5’-ATGAGATCACAGCTATGACTGGTG-3’，下游5’-GCATTGCACATCTCTATGGTGACTAG-3’，產物651 bp；PLB序列上游5’-TACCTTACTCGCTCGGCTATC-3’，下游5’-CAGAAGCATCACAATGATGCAG-3’，產物141 bp；內參照β-actin上游5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’，下游5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3’，產物312 bp。

總反應體系為50 μL，其中cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Buffer 25 μL，目標產物的引物2 μL(上、下游各1 μL)，β-actin引物2 μL(上下游各1 μL)，RNase-free雙蒸水補足至50 μL，混勻后在ABI7500型實時熒光定量PCR基因擴增儀(ABI)上進行PCR擴增。反應條件分別為：預變性 94 ℃4 min，94 ℃15 s，60 ℃1 min，共40次循環；隨后進行溶解曲線反應，得到所有標本的所有記錄點曲線。ABI Prism 7500 SDS軟件將自動進行數據分析，調整基線，計算出threshold cycle (CT值)，即每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。根據每個樣本的CT值，通過公式計算出每個相對于內參照β-actin的定量，從而比較各組樣本的表達變化情況。

2.4MyoCa2+濃度測定 取30 g左右心室肌組織參照Beuckelmann等[10]方法測定并加以改良。LC-240型熒光分光光度計(P-E)測定細胞懸液熒光F(激發波長340 nm，發射波長500 nm)。分別加入0.1%Triton X-100和2.5 mmol/L乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)后測定最大熒光值(Fmax)和最小熒光值(Fmin)。按公式(F-Fmin)/×Fmax-F)×224計算MyoCa2+濃度，單位為nmol/L。

2.5肌漿網Ca2+-ATP酶活性測定 參照Jones等[11]差速離心法制備肌漿網，所有操作均在冰上完成。取液氮中凍存30 mg左右心室肌1塊，剪碎后置離心管，加入5倍體積A液(10 mmol/L NaHCO3，5 mmol/L NaN3，pH 7.0)，冰上勻漿后13 000×g離心10 min，留上清液，沉淀加5倍A液，勻漿后13 000×g離心10 min，留上清液加第1次上清液合并后13 000×g離心20 min，棄沉淀，上清液再離心(43 000×g)30 min，棄上清液，沉淀加2倍體積B液(0.6 mol/L KCl，30 mmol/L組氨酸，pH 7.0)，混勻再離心(43 000×g)30 min，棄上清液，沉淀加1 mL C液(0.25 mol/L蔗糖，30 mmol/L組氨酸，pH 7.0)充分混勻，取100 μL采用考馬斯亮藍法測定肌漿網蛋白濃度，無機磷酸根法測定肌漿網Ca2+-ATP酶活性。酶活性單位為1 mmol Pi·g-1protein·h-1。

3統計學處理

重復腎及輸尿管畸形及輸尿管異位開口,是泌尿系常見的先天畸形疾病。根據畸形部位和特征,重復腎及輸尿管畸形分為完全性、不完全性兩種。完全性重復指一側或雙側輸尿管全長重復,輸尿管可分別開口于膀胱或尿道等部位;不完全性重復指一側或雙側輸尿管部分重復、匯合后共同開口于膀胱。單側重復較雙側多6倍。完全重復時,上輸尿管口位于下內側,而下輸尿管口位于上外側。如果重復的輸尿管開口于膀胱以外,則稱為輸尿管異位開口。該疾病女性多于男性,臨床表現取決于異位開口部位,男性異位開口多見于后尿道及精囊,女性多見于尿道、前庭和陰道,女性患者的典型癥狀是既有正常自行排尿,又有持續漏尿或尿失禁。

結 果

1動物模型表型與行為特征改變(表1)

各組新生仔鼠BW比較差異顯著(Plt;0.01)。正常對照組新生仔鼠體重增加快，活動性強。甲減組新生仔鼠體重增加緩慢，顯著低于同日齡正常組新生仔鼠(Plt;0.01)，且體形小，尾短，行動遲緩，反應遲鈍，張眼晚。L-T4治療組新生仔鼠一般情況較甲減組仔鼠有明顯改善，體形增大、反應靈敏度增強，體重較同日齡甲減組仔鼠顯著增加(Plt;0.01)，但仍低于同日齡正常組仔鼠水平(Plt;0.01)。

表1 各組新生仔鼠BW、HW和HW/BW重的比較

2HW和HW/BW的變化(表1)

甲減組新生仔鼠HW顯著低于同日齡對照組仔鼠(Plt;0.05)，但HW/BW無顯著差異(Pgt;0.05)；L-T4治療組各日齡段新生仔鼠HW顯著高于甲減組同日齡仔鼠(Plt;0.01)，除3日齡外(Pgt;0.05)，L-T4治療組HW/BW較同日齡甲減組仔鼠顯著升高(5、7日齡Plt;0.05)。

3血清甲狀腺激素水平的變化(表2)

甲減組新生仔鼠各日齡段血清FT4水平接近藥盒檢測底限(2.8 pmol/L)，明顯低于同日齡對照組新生仔鼠(Plt;0.01)；血清FT3水平較同日齡對照組仔鼠相比也顯著降低(Plt;0.01)；血清TSH水平較同日齡對照組仔鼠顯著升高(Plt;0.01)。L-T4治療組仔鼠血清FT3和FT4水平較同日齡甲減組仔鼠顯著升高(Plt;0.01)，血清TSH水平顯著下降(Plt;0.01)，但治療組各激素水平均尚未達到同日齡正常組水平(Plt;0.05)。

表2 各組新生仔鼠血清FT3、FT4與TSH水平的比較

4心肌SERCA2a與PLBmRNA表達變化(表3)

表3 各組新生仔鼠心肌SERCA2a、PLB及SERCA2a/PLB mRNA水平的比較

5MyoCa2+濃度的變化(圖1)

各組間同日齡MyoCa2+濃度具有顯著差異(Plt;0.01)，3、5、7日齡甲減組仔鼠MyoCa2+濃度分別為(131.63±33.86)nmol/L、(152.74±38.67)nmol/L、(188.23±42.33)nmol/L，顯著高于同日齡對照組(88. 34±27.43)nmol/L、(95.23±28.92)nmol/L、(110.22±31.52)nmol/L(Plt;0.01)。3、5、7日齡L-T4治療組仔鼠MyoCa2+濃度分別為(100.30±29.69)nmol/L、(116.65±31.75)nmol/L、(137.52±34.43)nmol/L，顯著低于同日齡甲減組仔鼠(Plt;0.05)。

6心肌肌漿網Ca2+-ATP酶活性的變化(圖2)

對照組、甲減組與L-T4治療組新生仔鼠的肌漿網Ca2+-ATP酶活性隨著日齡增加而增加。各組間同日齡心肌肌漿網Ca2+-ATP酶活性具有顯著差異(Plt;0.01)，3、5、7日齡甲減組仔鼠肌漿網Ca2+-ATP酶活性分別為(1.57±0.26)mmol Pi·g-1protein·h-1、(1.78±0.33)mmol Pi·g-1protein·h-1、(2.06±0.32)mmol Pi·g-1protein·h-1，顯著低于同日齡對照組(2.34±0.42)mmol Pi·g-1protein·h-1、(2.68±0.44)mmol Pi·g-1protein·h-1、(3.21±0.50)mmol Pi·g-1protein·h-1(Plt;0.01)，分別降低32.91%、33.58%、35.83 %。3、5、7日齡L-T4治療組仔鼠肌漿網Ca2+-ATP酶活性分別為(1.98±0.35)mmol Pi·g-1protein·h-1、(2.29±0.40)mmol Pi·g-1protein·h-1、(2.70±0.42)mmol Pi·g-1protein·h-1，顯著高于同日齡甲減組仔鼠(Plt;0.05)，分別上升26.11%、28.65%、31.07%，但仍低于同日齡對照組(Plt;0.05)。

Figure 1. Analysis of concentration of ventricular MyoCa2+ in hypothyroid, L-T4 and control groups. ±s. n=10. *plt;0.05 vs control group; #Plt;0.05 vs hypothroid group.

Figure 2. Analysis of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase activity in hypothyroid, L-T4 and control groups. ±s. n=10. *Plt;0.05 vs control group;#Plt;0.05 vs hypothroid group.

討 論

甲狀腺激素是調節細胞多種功能的一種重要生理性激素，可影響到細胞代謝、蛋白質合成和物質轉運，尤其對小兒生長發育和多器官系統的發育起著重要作用。圍生期甲狀腺功能減退是由胎兒甲狀腺發育不良或者孕母甲狀腺激素缺乏引起，出生患兒即表現為先天性甲狀腺功能減退。本實驗在孕鼠孕15 d至生后15日齡給予PTU灌胃，所生仔鼠體重減輕，生長發育遲緩，血清FT3、FT4下降，TSH升高，提示模型制備是成功的。本研究同時給予部分甲減仔鼠以L-T4治療，結果發現L-T4替代治療后仔鼠血清甲狀腺激素水平顯著上升，替代治療對恢復甲狀腺功能有顯著效果，然而甲減仔鼠在短期內(7日齡)尚未到達正常水平，推測可能與替代治療持續時間或治療劑量有關。

在本研究中，我們發現新生甲減仔鼠BW與HW均顯著下降，HW/BW無顯著變化，提示體內低甲狀腺激素水平對體格生長及心臟的發育成熟均產生了顯著的影響。經L-T4治療后，新生仔鼠BW與HW均明顯上升，其中HW在7日齡時已接近正常水平，HW/BW在5日齡和7日齡時也均高于甲減組仔鼠，7日齡還高于正常組仔鼠，提示隨著甲狀腺功能的逐漸恢復，仔鼠體格生長與心臟發育均呈現追趕現象，且隨著日齡增長和激素水平的提高，對心臟的發育的影響似乎更大。

心肌細胞內Ca2+濃度的變化是細胞興奮-收縮偶聯和心肌收縮舒張功能的主要決定因子。胞漿內游離鈣濃度異常增高可致心肌細胞鈣超載，從而導致心功能障礙。心肌肌漿網則是調控心肌細胞內Ca2+穩態的重要細胞器，肌漿網Ca2+-ATP酶為存在于肌漿網上調控細胞內Ca2+濃度的最重要的鈣轉運蛋白，主要靠水解ATP將細胞質中的Ca2+逆濃度梯度泵入肌漿網內，使心肌細胞內Ca2+濃度急劇下降而介導舒張，同時肌漿網內貯存的Ca2+又將是下一次心肌收縮的基礎[4,5]。磷酸受納蛋白(PLB)是存在于肌漿網中的內源性抑制物，為肌漿網鈣泵的活性調節蛋白。PLB的過度表達可抑制SERCA2a的活性，降低其對Ca2+的親和力, Ca2+濃度減少，從而引起心肌細胞收縮和舒張頻率下降，心肌收縮時間延長。

鈣轉運蛋白在調控成年甲減動物心功能改變中的可能機制已有部分研究，其中有報道大鼠和兔的SERCA2a mRNA及蛋白表達均下降，給予T3治療后SERCA2a表達可顯著上升[12]，然而對于PLB表達的研究結果并不一致，甲減動物心肌PLB的表達變化為上升或下降甚至無變化者均有報道[12-14]。迄今為止關于甲狀腺激素對鈣轉運蛋白的調節大多局限于成年動物模型的研究，而圍生期甲減是否會對出生的新生仔鼠心肌肌漿網鈣轉運蛋白的表達產生影響以及甲狀腺素替代治療的反應如何，目前則尚未見報道。

本實驗通過real-time PCR方法對各組新生仔鼠的心肌SERCA2a及PLB mRNA表達水平進行研究，發現甲減仔鼠SERCA2a mRNA表達下降，PLB mRNA表達升高，說明甲狀腺激素減少直接影響了SERCA2a及PLB的基因轉錄水平，由于SERCA2a表達的下調及PLB表達的上調，SERCA2a/PLB比值下降，對Ca2+-ATP酶活性的抑制作用加強，使后者對胞漿內游離Ca2+的再攝取功能減低，出現松弛功能障礙。經L-T4替代治療后，SERCA2a mRNA表達顯著上升，PLB mRNA表達顯著下降，兩者比例上升，提示甲狀腺素替代治療對調整鈣轉運蛋白的基因轉錄，從而最終改善心功能十分有效。我們同時發現治療組仔鼠其SERCA2a mRNA表達在短期治療(5-7 d)后可達到正常對照組水平，提示甲狀腺激素水平的上升對SERCA2a mRNA表達的影響較大，替代治療可在短期內使之完全恢復正常。然而PLB mRNA表達以及兩者比例SERCA2a/PLB仍未達到正常組水平，推測其原因可能與甲狀腺激素水平尚未在短期內恢復正常有關，繼續替代治療是否能完全逆轉尚需進一步研究。

本研究同時發現新生甲減大鼠MyoCa2+濃度升高，肌漿網鈣泵活性顯著下降，說明甲狀腺激素水平可影響肌漿網對Ca2+的轉運，引起肌漿網 Ca2+攝取速度減慢和攝取量減少，導致心肌細胞鈣超載，心肌舒張緩慢和舒張不完全，繼而再影響心肌興奮-收縮偶聯，最終引起心肌收縮力降低。本實驗同時對部分新生甲減仔鼠進行L-T4替代治療，結果發現治療后隨著甲狀腺激素水平的上升，其MyoCa2+濃度顯著降低，提示甲狀腺素替代治療能減輕甲減引起的心肌細胞內游離鈣增高，并使肌漿網鈣泵活性增加，但在7日齡內尚未到達正常組水平，鈣泵活性在生后早期短期替代治療后未能完全恢復正常，推測可能與甲狀腺功能尚未完全恢復正常有關。

綜上所述，本研究提示甲狀腺激素減少可使新生大鼠心肌SERCA2a表達下降，PLB表達上升，SERCA2a/PLB比值下降，直接抑制了肌漿網Ca2+-ATP酶活性，導致心肌細胞內Ca2+超載，這一系列反應可能為先天性甲狀腺功能減退癥引起新生兒心臟收縮和舒張功能下降[2]的重要分子機制之一，早期L-T4替代治療后以上指標可得到部分或全部恢復，從而促使受損心功能在生后短期內得到改善。

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AlterationofmyocardialsarcoplasmicreticulumCa2+transportproteinexpressioninneonatalhypothyroidrats

MAO Shan-shan, ZHAO Zheng-yan

(1DepartmentofChildHealthCare,TheChildren’sHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310003,China.E-mail:maoshanshan33@163.com)

AIM: To investigate the alteration of sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+transport proteins including sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a(SERCA2a) and phospholamban(PLB) mRNA expression as well as the alteration of myocardial SR Ca2+-ATPase activity in neonatal hypothyroid rats, and to explore the effect of levothyroxine(L-T4) substitution therapy on the above indexes.METHODSHypothyroidism was induced by the administration of propylthiouracil (PTU, 50 mg/d) to the pregnant SD rats by gavage beginning on embryonic day 15 and continuing throughout the lactational period. A subgroup of neonatal hypothyroid rats were intraperitoneally injected with L-T4levothroxine (20 μg/kg BW daily), starting from the day of birth. Other pregnant SD rats

normal saline instead of PTU. The samples of the rats in all 3 groups were harvested at postnatal day 3, 5 and 7 respectively (n=10). After measurement of serum thyroid hormone levels, the hearts were removed and the ventricles were weighed (HW). The concentration of calcium in ventricular myocardium(ventricular myoCa2+) was detected by fluorospectrophotometry and the activity of SR Ca2+-ATPase was determined by the inorganic phosphorus method. The mRNA expression of SERCA2a and PLB was also detected by real-time PCR.RESULTSNeonatal hypothyroid rats had a significant lower level of SERCA2a mRNA (Plt;0.05) and a higher level of PLB mRNA (Plt;0.01), and subsequent lower SERCA2a/PLB at each postnatal day (Plt;0.01) was observed. Compared with hypothyroid group, the mRNA expression of SERCA2a significantly increased (Plt;0.05) and that of PLB significantly decreased (Plt;0.05) in L-T4treatment group. The concentration of ventricular MyoCa2+in hypothyroid group was significantly higher than that in control group (Plt;0.01), and that in L-T4treatment group showed a significant decrease as compared with hypothyroid group (Plt;0.05). The activity of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase in hypothyroid group was significantly lower than that in control group (Plt;0.01), and that in L-T4treatment group showed a significant increase as compared to hypothyroid group (Plt;0.05).CONCLUSIONThe deficiency of thyroid hormone, resulting in decreased expression of SERCA2a mRNA as well as increased PLB mRNA, contributes to the reduction of SR Ca2+-ATPase activity in neonatal rats. This may be one of the most important mechanisms of myocardial systolic and diastolic dysfunctions.

Hypothyroidism; Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase; Phospholamban; Rats,neonatal

1000-4718(2011)04-0763-06

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.027

2010-09-25

2011-02-25

浙江省教育廳科研資助項目(No.Y201019211)

△通訊作者 Tel：0571-87061007-12121; E-mail:maoshanshan33 @163.com