自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤在H2O2引起的神經膠質瘤U251細胞損傷中的作用*

孔曉霞， 張宏宇， 鐘加滕， 康勁松， 孫連坤△

(1溫州醫學院機能實驗教學中心，浙江 溫州 325035; 2吉林大學白求恩醫學院病理生理學系，吉林 長春 130021)

自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤在H2O2引起的神經膠質瘤U251細胞損傷中的作用*

孔曉霞1， 張宏宇2， 鐘加滕2， 康勁松2， 孫連坤2△

(1溫州醫學院機能實驗教學中心，浙江 溫州 325035;2吉林大學白求恩醫學院病理生理學系，吉林 長春 130021)

目的探討自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)在H2O2誘導的神經膠質瘤U251細胞損傷過程中的作用。方法實驗分為4組：正常對照組、10 mmol/L 3-MA組、1 mmol/L H2O2組、1 mmol/L H2O2+10 mmol/L 3-MA組。MTT法檢測各組的U251細胞增殖率；MDC染色檢測細胞自噬空泡的變化；Hoechst 33342染色檢測細胞核染色質凝聚變化；流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果與對照組相比，單獨應用3-MA對U251細胞無明顯影響。H2O2作用組U251細胞增殖率明顯降低，細胞內出現自噬空泡，細胞核染色質凝聚，細胞凋亡率增加。3-MA與H2O2聯合作用于U251細胞時，與單獨應用H2O2組相比，抑制了H2O2引起的胞內自噬空泡的積聚，但細胞凋亡率明顯增加。結論自噬抑制劑3-MA能夠一定程度地抑制H2O2誘導的U251細胞自噬，但促進了細胞凋亡，表明自噬在H2O2誘導的神經膠質瘤U251細胞損傷過程中很可能起到保護性作用。

自呑噬作用； U251細胞；3-甲基腺嘌呤; 過氧化氫

自噬(autophagy)是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程[1,2]。已有研究表明自噬在饑餓、氧化應激、缺氧等條件下對細胞具有一定程度的保護作用[3,4]。但是，過度激活的自噬會引起程序性細胞死亡，導致細胞生存率下降，這種細胞死亡方式被定義為II型細胞程序性死亡，即自噬性細胞死亡(autophagic cell death)[5,6]。本實驗應用H2O2復制神經膠質瘤U251細胞損傷模型，并利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)協同作用，初步探討自噬在神經膠質瘤U251細胞氧化損傷中的作用。

材 料 和 方 法

1神經膠質瘤U251細胞培養

神經膠質瘤U251細胞株由吉林大學白求恩醫學院病理生理學教研室保存，細胞置于完全培養基(10% Hyclone新生牛血清，IMDM培養液，pH 7.4)中，37℃、5% CO2培養箱中培養。

2實驗分組

將U251細胞分為以下4組：正常對照組、3-MA組、H2O2組和H2O2+3-MA組。H2O2和3-MA(Sigma)的終濃度分別為1 mmol/L和10 mmol/L。

3噻唑藍(MTT)法測定細胞生存率

取對數生長期U251細胞，經消化制成細胞懸液，以每孔100 μL、1×104細胞數接種于96板，12 h后按照實驗分組加藥，20 h后加入MTT(5 g/L)20 μL，繼續培養4 h后吸出培養液，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，570 nm測其吸光度值。

4MDC染色檢測細胞自噬空泡變化

丹酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC) 是自噬空泡的標志物，通過MDC染色可以觀察判斷細胞自噬過程的發生[7]。取對數生長期U251細胞，經消化制成細胞懸液，以5×104cells/well數接種于24孔板中，細胞貼壁后，按照實驗分組在藥物處理12 h后，PBS洗2遍，棄上清，以4%冰冷的多聚甲醛，4 ℃下固定15 min，PBS洗2遍，加入終濃度50 μmol/ L MDC (Sigma)，37 ℃孵育60 min，PBS洗2遍。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞自噬空泡的變化并進行熒光定量分析。

5Hoechst33342染色檢測細胞凋亡

取對數生長期U251細胞，經消化制成細胞懸液，以每孔5×104cells/well數接種于24孔板中，細胞貼壁后，按照實驗分組在藥物處理后12 h，PBS洗2遍，棄上清，加入終濃度1 mg/L的 Hoechst 33342 (Sigma)染色，37 ℃孵育15 min，PBS洗2遍，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色質凝集及形態變化并統計熒光染色陽性細胞百分比。

6流式細胞術檢測細胞凋亡率

取對數生長期U251細胞，經消化制成細胞懸液，以5×106cells/well數接種于培養瓶中，細胞貼壁后，按照實驗分組在藥物處理后12 h，PBS洗2遍，收集細胞，棄上清，分別加入終濃度1 mg/L PI和Annexin V-FITC (Sigma)，37 ℃孵育15 min，PBS洗2遍，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

7統計學處理

結 果

13-MA和H2O2對U251細胞增殖率的影響

單獨應用3-MA作用于U251細胞時，細胞增殖率未見明顯變化。單獨應用1 mmol/L H2O2作用24 h，細胞增殖率明顯下降，為(76.4±3.9)%,Plt;0.01；當3-MA與H2O2聯合作用時，細胞增殖率與單獨應用H2O2組相比明顯降低，為(63.7±5.2)%,Plt;0.05，見圖1。

Figure 1. The vitality of U251 cells treated with H2O2 and /or 3-MA for 24 h .±s.n=3.**Plt;0.01 vs control group；#Plt;0.05 vs H2O2 group.

2MDC染色檢測細胞自噬空泡變化

MDC染色結果表明單獨應用3-MA作用于U251細胞時，細胞內無明顯自噬空泡出現，熒光定量分析平均熒光強度為(86.2±23.4)%，與對照組平均熒光強度[(78.1±16.3)%]相比無明顯差異。單獨應用H2O2作用12 h，細胞內大量自噬空泡積聚，平均熒光強度為(219.6±59.8)%,Plt;0.01，表明有自噬發生；當3-MA與H2O2聯合作用時，與單獨應用H2O2組相比，自噬空泡明顯減少，平均熒光強度為(108.5±37.2)%,Plt;0.01，見圖2。

3Hoechst33342染色檢測H2O2和3-MA對U251細胞凋亡的影響

單獨應用3-MA作用于U251細胞時，細胞核形態未見明顯變化，無明顯細胞凋亡發生，Hoechst 33342染色陽性細胞百分比為(1.8±0.3)%。單獨應用H2O2作用12 h，細胞核碎裂，染色質凝聚，引起細胞凋亡，陽性細胞百分比為(8.7±2.5)%,Plt;0.01；當3-MA與H2O2聯合作用時，細胞凋亡與單獨應用H2O2組相比顯著增強，陽性細胞百分比為(14.5±3.8)%,Plt;0.01，見圖3。

Figure 2. MDC staining of the autophagic vacuoles in U251 cells treated with H2O2 and/or 3-MA for 12 h (×800).

Figure 3. Hoechst 33342 staining of cell apoptotic chromatin condensation in U251 cells treated with H2O2 and/or 3-MA for 12 h (×600).

4流式細胞術檢測細胞凋亡率

與正常對照組相比，單獨應用3-MA作用于U251細胞時細胞凋亡率無明顯變化。單獨應用H2O2作用12 h，細胞凋亡率明顯增加，為(9.6±1.5)%,Plt;0.01；當3-MA與H2O2聯合作用時，與單獨應用H2O2組相比，細胞凋亡率顯著增加，為(15.4±3.1)%,Plt;0.01，見圖4。

Figure 4. Flow cytometry analysis of cell apoptotic ratio of U251 cells treated with H2O2 and/or 3-MA for 12 h. **Plt;0.01 vs control group；#Plt;0.05 vs H2O2 group.

討 論

有研究表明相同誘導因素在不同細胞中可分別誘發自噬或凋亡；近年來越來越多的研究提示二者在某些情況下可以相互拮抗或促進，可先后發生或同時共存于同一細胞，參與自噬和凋亡的分子也可能存在交叉，這些分子在自噬與凋亡兩種程序性細胞死亡中可發揮正向或負向作用[8]。近來有報道表明活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是自噬發生過程中的信號分子，高水平的ROS能氧化細胞脂質，DNA和蛋白，并且能引起線粒體，溶酶體和其它的細胞器功能紊亂。然而通過自噬降解和再循環受損的細胞蛋白等不同的防御機制能抵抗這種氧化應激[9]。然而，自噬在細胞中的作用以及自噬與凋亡之間的關系依然存在著爭議，相關機制還需進一步闡明。

本實驗結果表明，H2O2作用于U251細胞，引起了U251細胞發生自噬和凋亡，提示氧化損傷過程中兩種程序性細胞死亡形式同時存在并可能相互影響。MTT實驗結果顯示，H2O2作用于U251細胞時，能明顯抑制U251細胞增殖(Plt;0.01)；而自噬抑制劑3-MA與H2O2聯合應用時，細胞增殖率卻沒有改善，反而有進一步下降，推測自噬在此過程中可能起到保護作用。激光共聚焦顯微鏡觀察Hoechst 33342染色，H2O2作用12 h后，細胞核發生回縮，染色質凝集，表明H2O2能引起U251細胞凋亡。同時通過MDC染色發現，H2O2作用后細胞內有大量自噬空泡積聚，而3-MA與H2O2聯合應用時，明顯抑制了自噬的發生。3-MA與H2O2聯合應用時，細胞核凋亡顯著增強，流式細胞術分析結果表明3-MA的聯合應用導致細胞凋亡率顯著增加。上述結果表明，自噬抑制劑3-MA能夠抑制H2O2引起的細胞自噬，卻促進了細胞凋亡，暗示自噬在U251細胞氧化損傷過程中很可能起到了一種保護作用。有研究表明營養物質或生長因子缺乏時，機體可以通過自噬方式為細胞提供能量，促進細胞存活。Scherz-Shouval等[10]的研究表明，ROS能夠調節營養匱乏引起的自噬，并且是一種明確的促生存機制；營養匱乏能夠導致部分經由ClassIII/PI3K途徑的線粒體活性氧積聚，激活自噬基因Atg4，這很可能是ROS誘導自噬發生的關鍵。通過化學或者生理學手段抑制自噬，能夠啟動HeLa細胞中線粒體外膜透化以及進一步的caspase活化，導致細胞凋亡[11]。我們推測，在自噬和凋亡并行發生的情況下，自噬更趨向于是一種通過降解以及再循環來提供能量的促生存機制。

以上結果表明，自噬抑制劑3-MA抑制了H2O2引起的細胞自噬，卻促進了細胞凋亡，說明自噬的發生能夠在一定的程度上減輕氧化應激引起的細胞損傷，對細胞起到一定的保護作用。進一步研究自噬與凋亡的關系，通過抑制細胞自噬促進凋亡性細胞死亡，很可能成為腫瘤治療中的一種新策略。

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Roleofautophagyinhibitor3-methyladenineintheinjuryofU251cellsinducedbyH2O2

KONG Xiao-xia1, ZHANG Hong-yu2, ZHONG Jia-teng2, KANG Jin-song2, SUN Lian-kun2

(1TeachingCenterofFunctionalExperiment,WenzhouMedicalSchool,Wenzhou325035,China;2DepartmentofPathophysiology,NormanBethuneSchoolofMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China.E-mail:sunlk@jlu.edu.cn)

AIM: To investigate the role of autophagy inhibitor 3-methyladenine(3-MA) in the injury of U251 glioma cells induced by H2O2.METHODSThe following groups in this study were set up: control group, 10 mmol/L 3-MA group, 1 mmol/L H2O2group and 1 mmol/L H2O2+10 mmol/L 3-MA group. The viability of U251 cells in each group was detected by MTT assay. Autophagic vacuoles in the cells were observed by staining with MDC. The cells were stained with Hoechst 33342 to determine the chromatin condensation. Cell apoptotic ratio was measured by flow cytometry analysis.RESULTSCompared with control group, no effect of 3-MA on the viability of U251 cells was observed. In H2O2group, the cell viability decreased and cell apoptotic ratio increased.The autophagic vacuoles and nuclear chromatin condensation in the cells were also detected. Compared with H2O2group, addition of 3-MA inhibited the increase in autophagic vacuoles but exacerbated the apoptosis.CONCLUSIONAutophagy inhibitor 3-MA inhibits autophagy partially, but exacerbates apoptosis in U251 cells, indicating that autophagy exerts protective effect in the process of injury in U251 cells induced by H2O2.

Autophagocytosis; U251 cells; 3-methyladenine; Hydrogen peroxide

1000-4718(2011)04-0695-04

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.014

2010-10-19

2011-02-16

吉林省科技廳資助項目(No.200705373)；溫州醫學院科研啟動基金資助項目(No.QTJ09014)

△通訊作者Tel: 0431 - 85619485; E - mail: sunlk@jlu.edu.cn