H. polygyrus感染對T細胞介導的炎癥性腸病的影響及其作用機制研究*

李旺林, 蘭 平, 吳小劍, 饒本強, 何曉生, 吳現瑞, 鄒一豐, WALKER Allan, 石海寧△

(1中山大學附屬第六醫院結直腸外科, 廣東 廣州 510655; 2哈佛大學醫學院麻省總醫院黏膜免疫實驗室，美國馬薩諸塞州 查爾斯鎮 02129；3廣州醫學院附屬廣州市第一人民醫院，廣東 廣州 510180)

H. polygyrus感染對T細胞介導的炎癥性腸病的影響及其作用機制研究*

李旺林1,2，3, 蘭 平1△, 吳小劍1, 饒本強1, 何曉生1, 吳現瑞1, 鄒一豐1, WALKER Allan2, 石海寧2△

(1中山大學附屬第六醫院結直腸外科, 廣東 廣州 510655;2哈佛大學醫學院麻省總醫院黏膜免疫實驗室，美國馬薩諸塞州 查爾斯鎮 02129；3廣州醫學院附屬廣州市第一人民醫院，廣東 廣州 510180)

目的研究多形螺旋線蟲(H.polygyrus)感染對CD4+輔助性T細胞介導的小鼠炎癥性腸病(IBD)的影響及其作用機制。方法用卵清蛋白(OVA)特異性的CD4+輔助性T細胞轉入重度聯合免疫缺陷(SCID)小鼠中制作IBD模型。將IBD小鼠感染H.polygyrus，14 d后處死小鼠，觀察結腸的組織學變化，用ELISA法和流式細胞術檢測腸系膜淋巴結中干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素-4(IL-4)的表達。另外，對感染H.polygyrus的IBD小鼠注射IL-4單克隆抗體以阻斷IL-4的分泌，9 d后處死小鼠，觀察相同的指標。結果與無感染組相比，感染H.polygyrus的IBD小鼠結腸病損明顯加重，腸系膜淋巴結中IL-4水平明顯增高，IFN-γ水平明顯降低(均Plt;0.05)。在IL-4阻斷實驗中，與無IL-4阻斷組相比，IL-4阻斷組結腸病損明顯減輕，IL-4水平明顯降低，IFN-γ水平明顯增高(均Plt;0.05)。結論H.polygyrus感染在CD4+T細胞介導的IBD模型早期加重了炎癥反應，其作用可能是通過誘導Th2細胞因子的分泌、抑制Th1細胞因子的分泌來實現的，提示用蠕蟲治療IBD時需謹慎。

炎性腸疾病； 多形螺旋線蟲； T淋巴細胞，輔助性

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases， IBD)是一組病因不明的慢性腸道炎癥性疾病， 包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis， UC)和克羅恩病(Crohn’s disease， CD)[1]。它是廣泛影響健康的疾病之一,病理特征是結腸的黏膜及黏膜下層存在大量的炎癥細胞浸潤以及激活CD4輔助T細胞,自主免疫過度激活,導致嚴重的透膜性腸道黏膜炎癥,產生大量炎癥因子和趨化因子[2,3]。

近年來，我們已經觀察到免疫介導性疾病(包括IBD)的發病率和寄生蟲感染之間呈負相關關系[4]。據估計，全世界30億人感染蠕蟲。蠕蟲感染的重要性不僅包括直接的蠕蟲致病作用，而且對宿主的免疫系統起調節作用，這可能會改變宿主對其它抗原的反應，并導致另外的免疫病理性損傷。因此，我們構建了CD4+T細胞介導的IBD動物模型，并進一步研究蠕蟲感染與炎性腸病之間的關系及其作用機制。

材 料 和 方 法

1動物

選擇6-8周的雌性重度聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠(SPF 級), 以高壓蒸汽消毒的食物和水喂養。

2卵清蛋白(ovalbumin,OVA)特異性CD4+T細胞(KJT細胞)的提取

用CO2吸入法處死DO11.10小鼠(OVA特異性 T 細胞的轉基因小鼠)，取出小鼠的外周淋巴結和脾臟。將外周淋巴結和脾臟分組研磨(溶液為完全DMEM)，用70 μm的濾器過濾。脾臟組加入2 mL紅細胞裂解液，混合、孵育5 min。制備淋巴細胞懸液，以CD4+T細胞提純柱提純CD4+T細胞。

3炎性腸病模型的制作及其監測

用已經制備好的來自DO11.10小鼠的OVA特異性CD4+輔助性T細胞經尾靜脈注射轉移進入SCID小鼠(5-8×106/鼠)。在蠕蟲感染和細胞轉入的前1 d，用鏈霉素(267 g/L，75 μL/鼠)處理小鼠。24 h后，口服OVA特異性表達的E.coli(EOVA,5×109/鼠)。其后，每隔1 d喂養EOVA。將小鼠分為2組，一組感染多形螺旋線蟲(Heligmosoidespolygyus,H.polygyrus200/鼠),記為HP+KJ+EOVA組；另外一組不感染，記為KJ+EOVA組。每天監測臨床癥狀、糞便和體重的變化。評估結腸炎嚴重程度。

4處死SCID鼠

實驗14 d后，所有小鼠吸入CO2處死。

5結腸組織HE病理染色

打開腹腔，游離結腸，再沿縱軸將結腸切開并在生理鹽水中漂洗，觀察各組大鼠結腸的大體改變。沿縱軸在近側結腸分別剪取3段(上、中、下各1段)；以包埋液包埋，5 μm 連續切片，蘇木素/伊紅(haematoxylin and eosin, HE)染色。結腸病理變化采用改進的組織學評分系統進行評分[5]。

6淋巴細胞細胞因子ELISA檢測

打開腹腔，取出腸系膜淋巴結(mesenteric lymph node， MLN)。將外周淋巴結分組研磨(溶液為cDMEM)，用70 μm的濾器過濾。4 ℃、1 500 r/min離心8 min。離心后棄除上清。加入2 mL 完全DMEM溶液，將細胞震蕩溶解。取出1×107細胞數，將之調成5×109cells/L 完全DMEM。分別以CD3單克隆抗體和OVA孵育，置于CO2培養箱內, 5% CO2、37 ℃靜置培養。72 h后，收集培養液上清。置于-20 ℃凍存。以ELISA法檢測Th1細胞因子[干擾素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)]和Th2細胞因子[白細胞介素4 (interleukin-4,IL-4)]的表達量。

7淋巴細胞細胞因子流式細胞儀檢測

處死小鼠，取出腸系膜淋巴結。研磨組織，制備淋巴細胞懸液。取出1×107細胞數，溶解于2 mL 完全DMEM中(5×109cells/L)。加入PMA, 3 μL(200 mg/L)、ionomycin 4 μL (2 g/L)，混勻，37 ℃孵育2 h，再加入brefeldin A 4 μL (5 g/L)孵育2 h。以cytochrome標記的CD4單克隆抗體進行表面染色，然后用甲醛溶液固定。再加入破膜劑，冰上孵育20 min，然后用PE標記的IL-4單克隆抗體、FITC標記的IFN-γ單克隆抗體染色。最后再用甲醛固定。以流式細胞儀(fluorescence activated cell sorter，FACS)檢測染色標本。分析數據，得出各個細胞因子的比例數據。

8抗IL-4阻斷實驗

分為3組，分別為：KJ+EOVA組(無H.polygyrus感染)，HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組(有H.polygyrus感染、無抗IL-4阻斷)，HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組(有H.polygyrus感染、有抗IL-4阻斷)。前面2組按前面實驗進行處理。HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組，在第1、4、7 d分別用抗IL-4單克隆抗體(50 μg/鼠)進行腹腔注射。第9 d將小鼠處死。將結腸組織進行HE病理染色，觀察結腸病理變化的情況。取出腸系膜淋巴結，制作淋巴細胞懸液，以CD3單克隆抗體進行孵育，培養48-72 h。收集上清，ELISA檢測細胞因子含量。

9統計學處理

結 果

1非IL-4阻斷實驗結果

1.1KJ+EOVA組SCID鼠大便偶有稀爛、體重增加、毛發有光澤，飲食、活 動、精神狀態均基本正常。HP+KJ+EOVA組在5 d后部分小鼠可出現活動減少、體重減輕、毛發無光澤、飲食減少、黏液稀便等。所有實驗小鼠在14 d處死解剖，實驗期間所有小鼠均未死亡。實驗 14 d時，KJ+EOVA組小鼠體重增加(0.47±0.56)g；HP+KJ+EOVA組小鼠體重增加(0.45±0.57)g；2組比較無顯著差異，Pgt;0.05。

1.2結腸組織病理結果 HP+KJ+EOVA組結腸黏膜固有層細胞浸潤增多，結腸上皮破損增加，病理評分明顯高于對照組(KJ+EOVA組)，分別為(5.4±0.5)分和(2.1±0.7)分，差異顯著(Plt;0.05)，見圖1、2。

Figure 1. Histological changes of the colon in IBD mice(HE staining,×200). A: KJ+EOVA group; B: HP+KJ+EOVA group.

Figure 2. Histological scores of colons in IBD mice.

1.3MLN細胞因子ELISA檢測結果 CD3單克隆

抗體刺激的HP+KJ+EOVA組IFN-γ為(2.57±1.28)μg/L,KJ+EOVA組為(12.66±6.32)μg/L,Plt;0.05。 OVA刺激的HP+KJ+EOVA組IFN-γ為(6.47 ±1.57)μg/L,KJ+EOVA組為(12.39±4.10)μg/L,Plt;0.05。 CD3單克隆抗體刺激的HP+KJ+EOVA組IL-4為(0.08±0.09)μg/L,KJ+EOVA組為(0.02 ±0.02)μg/L,Plt;0.05。OVA刺激的HP+KJ+EOVA組IL-4為(0.14 ±0.14)μg/L,KJ+EOVA組未檢出,Plt;0.05，見圖3。

Figure 3. Cytokine production of MLN in IBD mice. A: anti-CD3-stimulated IFN-γ production；B：OVA-stimulated IFN-γ production; C: anti-CD3-stimulated IL-4 production；D：OVA-stimulated IL-4 production±s. *Plt;0.05 vs KJ+EOVA.

1.4MLN細胞因子流式細胞儀檢測結果 KJ+EOVA組IFN-γ(Th1) 的比率為(28.50±0.86)%，HP+KJ+EOVA組為(26.66±0.39)%，2組比較差異顯著(Plt;0.01)。KJ+EOVA組IL-4(Th2) 的比率為(3.26±0.18)%,HP+KJ+EOVA組為(5.70±0.49)%，2組比較差異顯著(Plt;0.01)。KJ+EOVA組中，Th1/Th2 的比率為(8.76±0.43)，HP+KJ+EOVA組為(4.71±0.45)，2組比較差異顯著(n=5,Plt;0.01)，見圖4。

Figure 4. FACS results of MLN cytokine production . A: KJ+EOVA group; B: HP+KJ+EOVA group.

2IL-4阻斷實驗結果

2.1KJ+EOVA組SCID鼠大便偶有稀爛、體重增加、毛發有光澤，飲食、活動、精神狀態均基本正常。HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組在5 d后部分小鼠可出現活動減少、體重減輕、毛發無光澤、飲食減少、黏液稀便等。HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組SCID鼠大便偶有稀爛、體重增加、毛發有光澤，飲食、活 動、精神狀態均基本正常。所有實驗小鼠在9 d處死解剖，實驗期間所有小鼠均未死亡。實驗第9 d時，KJ+EOVA組小鼠體重增加(-0.08±0.85)g；HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組小鼠體重增加(-0.90±0.80)g；HP+KJ+EOVA(anti-IL-4) 組小鼠體重增加(-0.80±0.45)g；3組之間兩兩比較均無顯著差異，Pgt;0.05。

2.2結腸組織病理結果 HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組結腸與HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，固有層細胞浸潤減少，黏膜上皮破損好轉，炎癥情況明顯減輕，差異顯著(Plt;0.05),見圖5、6 。

2.3MLN細胞因子ELISA檢測結果 CD3單克隆抗體刺激的HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組IFN-γ為(0.32 ±0.28) μg/L, HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組為(2.74±1.16) μg/L,KJ+EOVA組為(3.52 ±2.44) μg/L。KJ+EOVA 組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；KJ+EOVA組和HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組比較，差異無統計學意義(Pgt;0.05)。OVA刺激的HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組IFN-γ為(0.34 ±0.12) μg/L, HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組為(1.82±1.75) μg/L,KJ+EOVA組為(2.53 ±2.19) μg/L。KJ+EOVA 組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；KJ+EOVA組和HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組比較，差異無顯著(Pgt;0.05),見圖7A、B。

Figure 5. HE staining of the mouse colon section in IL-4 blocking experiment(×200). A: KJ+EOVA group ; B: HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4) group; C: HP+KJ+EOVA(anti-IL-4) group.

Figure 6. Histological scores of colons in mice in IL-4 blocking experiment.n=4.

CD3單克隆抗體刺激的HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組IL-4為(0.07 ±0.06) μg/L, HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組為(0.02±0.01) μg/L,KJ+EOVA組為(0.01 ±0.01) μg/L。KJ+EOVA 組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異有統計學意義(Plt;0.05)；HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異有統計學意義(Plt;0.05)；KJ+EOVA組和HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組比較，差異無統計學意義(Pgt;0.05)。OVA刺激的HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組IL-4為(0.08 ±0.04) μg/L, HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組IL-4為(0.01±0.02)μg/L,KJ+EOVA組IL-4為(0.00 ±0.00) μg/L。KJ+EOVA 組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組和HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4)組比較，差異顯著(Plt;0.05)；KJ+EOVA組和HP+KJ+EOVA(anti-IL-4)組比較，無顯著差異(n=4，Pgt;0.05),見圖7C、D。

Figure 7. Cytokine production of MLN in IL-4 blocking experiment.A:anti-CD3-stimulated IFN-γ production;B:OVA-stimulated IFN-γ production;C:anti-CD3-stimulated IL-4 production;D:OVA-stimulated IL-4 prodution±s.n=4.*Plt;0.05 vs HP+KJ+EOVA(no anti-IL-4).

討 論

IBD的發生由易感基因、環境因素與免疫系統之間復雜的交互作用所致，引起非特異性炎癥細胞激活，產生炎癥細胞因子和介質，引起腸黏膜組織炎癥及病理損害。隨著遺傳因素、環境因素、異常的免疫反應和機制的進展，IBD的治療發生了很大改變，腸道微環境的改善越來越重要。在動物模型和人體寄生蟲感染的研究，有大量的信息支持寄生蟲感染在炎癥腸病中的免疫調節作用。

蠕蟲是精妙的多細胞有機體，伴有復雜的生活史和發育史。它們多存在于溫熱氣候、擁擠、臟亂、食品衛生條件差的環境中。在這種環境中IBD的發生率卻很低[4]。宿主通過接觸土壤、食物和被污染的水而感染不同的蠕蟲。兒童更容易感染蠕蟲是因為他們經常會接觸土壤并且較少注意衛生習慣。蠕蟲能刺激宿主機體產生Th2型免疫反應[6]，以此來促進排蟲或限制寄生程度。許多蠕蟲可以在宿主腸道、膽道系統、腸系膜靜脈中生存多年。因此，從兒童時期感染寄生蟲開始，這些蠕蟲或它們的卵釋放的各種因子長年作用于腸黏膜表面，持續產生Th2型細胞因子。

在動物實驗中發現，感染寄生蟲可以阻止或延緩免疫失調動物模型的病情。用三硝基苯磺酸(TNBS)給動物灌腸制作Th1型結腸炎模型，其腸道黏膜炎癥的特點是產生大量IFN-γ及IL-12，在許多以T細胞介導的免疫反應性小鼠結腸炎模型中，通過應用IL-10、IL-4或IL-1中和抗體的治療取得了較好的效果[7-9]。這些都表明結腸炎動物模型與免疫調節異常之間有著密切關系。

估計全球30億人感染有寄生蟲[10]。在宿主免疫學研究中，H.polygyrus是一種自然界中的小鼠線蟲，大多寄生于十二指腸。研究結果表明，H.polygyrus能夠誘發劇烈的Th2型免疫反應[11]，并作為黏膜佐劑，改變宿主對口服蛋白抗原的反應[12，13]。因此，該蠕蟲感染引起了Th2型反應的升高，在有H.polygyrus感染小鼠中減少食物抗原的過敏性反應[14]。此外，蠕蟲感染驅動的Th2細胞極化的T細胞反應，與一些Th1細胞介導的疾病的改善是相關的，如Th1型糖尿病與幽門螺桿菌引起的胃炎[15-17]。也有證據支持：當并發病毒、細菌和寄生蟲感染時，蠕蟲感染引起的免疫反應加重[18-21]。雖然蠕蟲感染后導致的Th1/Th2免疫反應失衡被認為在免疫反應中發揮免疫調節作用，然而當多重感染或者疫苗出現在寄生蟲感染的個體中時，寄生蟲和其它病原體之間的相互關系是比較復雜的，目前并沒有得到充分的了解。

目前認為，結腸的黏膜及黏膜下層存在大量的炎癥細胞浸潤以及激活CD4+輔助T細胞,由于自主免疫過度激活,導致了IBD的發生。CD4+T細胞在炎性腸病的發病中起著重要作用。我們將OVA特異性的CD4+T細胞轉入SCID小鼠體內，由此誘發的腸炎更能模擬臨床IBD的發病過程。目前國內尚未見相關報道。我們的模型系統包括兩個能夠誘導自身免疫性疾病和Th反應的小鼠腸道感染因素：(1)H.polygyrus-OVA特異性E.coli-KJ T細胞SICD小鼠模型，其中寄生蟲能誘導強烈的Th2反應；(2)OVA特異性E.coli-KJ T細胞SCID小鼠模型，能產生自體免疫疾病。E.coli是一種革蘭陰性桿菌，是正常小鼠的細菌，能誘導腸道上皮表面病變。這種E.coli具有OVA特異性的抗原，而KJ T細胞有OVA特異性的受體，這將導致自身免疫性的腸炎。

我們在探討H.polygyrus干預CD4+T細胞誘導腸炎的效應性時發現，感染H.polygyrus的小鼠加重了CD4+T細胞誘導的腸炎小鼠結腸的病理學損傷。體重變化無明顯差異，可能與我們研究炎性腸病早期階段的變化、實驗時間較短有關。ELISA檢測細胞因子的表達，感染H.polygyrus組表現為IL-4升高和IFN-γ降低。通過流式細胞儀檢測細胞因子在CD4+T細胞中的分泌比率，感染H.polygyrus組亦表現為IL-4升高和IFN-γ降低。H.polygyrus感染的SCID小鼠腸炎模型中，腸系膜淋巴結Th1細胞分泌受抑，Th2細胞的分泌增加，說明H.polygyrus的感染可誘導它向Th2方向分化，而抑制它向Th1方向分化。Th1細胞分泌的細胞因子IFN-γ在炎癥早期對結腸組織有保護作用。H.polygyrus可以誘導強烈的Th2反應，通過Th1/Th2平衡，抑制Th1反應，降低了IFN-γ的分泌，從而導致IFN-γ對結腸組織保護性的減低，加重了結腸病理性損傷。本實驗結果與其它一些實驗結果不太一致，可能跟我們研究炎性腸病早期階段的變化、實驗時間較短有一定關系。但我們的實驗結果同樣可以提醒我們，在用寄生蟲對炎癥性腸病治療時，需要謹慎。對蠕蟲在炎性腸病中的效應作用和機制還需要進行進一步研究。

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TheeffectandmechanismofH.polygyrusinfectioninT-cell-mediatedinflammatoryboweldiseaseinmice

LI Wang-lin1,2,3, LAN Ping1, WU Xiao-jian1, RAO Ben-qiang1, HE Xiao-sheng1, WU Xian-rui1, ZOU Yi-feng1, WALKER Allan2, SHI Hai-ning2

(1DepartmentofColorectalSurgery,TheSixthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China;2MucosalImmunologyLaboratory,MassachusettsGeneralHospital,HarvardMedicalSchool,CharlestownMA02129,USA;3FirstMunicipalPeople’sHospital,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510180,China.E-mail:LWL3132008@sina.com)

AIM: To investigate the effect and mechanism ofHeligmosomoidespolygyrus(H.polygyrus) infection in mouse inflammatory bowel disease (IBD) mediated by CD4+helper T-cells.METHODSOvalbumin (OVA) -specific CD4+helper T-cells were transferred into SCID (severe combined immunodeficiency) mice to establish an IBD model. The IBD mice were infected byH.polygyrusand sacrificed 14 days later. The histological changes of the colon were observed, and the expression of interferon-gamma (IFN-γ) and interleukin-4 (IL-4) in mesenteric lymph nodes was detected by ELISA and flow cytometry. Additionally, IL-4 monoclonal antibody was intraperitoneally injected into theH.polygyrus-infected IBD mice to block the secretion of IL-4. The IL-4-blocking IBD mice were sacrificed 9 days later and the above indexes were also determined.RESULTSCompared with the non-infection group, theH.polygyrus-infected IBD mice had more severe colonic lesions, higher level of IL-4 and lower level of IFN-γ in mesenteric lymph nodes (allPlt;0.05). Compared with the non-blocking group, theH.polygyrus-infected IBD mice with IL-4 blockage had less colonic lesions, lower IL-4 level and higher IFN-γ level (allPlt;0.05).CONCLUSIONH.polygyrusinfection in CD4+T-cell-mediated IBD model promotes inflammation in the early stage probably by inducing the secretion of Th2 cytokine and inhibiting the secretion of Th1 cytokine. The finding suggests that using worms for treatment of IBD needs to be cautious.

Inflammatory bowel diseases;Heligmosomoidespolygyrus; T-lymphocytes, helper-inducer

1000-4718(2011)04-0732-07

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.021

2010-12-10

2011-02-23

國家自然科學基金資助項目(No. 30872461) ；廣東省自然科學基金資助項目 (No. 8151008901000107)

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