蟾蜍靈激活低分化鼻咽癌細胞氯通道*

羅海兵， 李華榮， 劉善文， 彭 爽， 劉振鋒， 葉文才， 張冬梅， 陳麗新△， 王立偉△

(1廣東醫學院生理學教研室，廣東 湛江 524023；暨南大學2醫學院, 3藥學院,廣東 廣州 510632)

蟾蜍靈激活低分化鼻咽癌細胞氯通道*

羅海兵1， 李華榮2， 劉善文2， 彭 爽2， 劉振鋒2， 葉文才3， 張冬梅3， 陳麗新2△， 王立偉2△

(1廣東醫學院生理學教研室，廣東 湛江 524023；暨南大學2醫學院,3藥學院,廣東 廣州 510632)

目的研究蟾蜍靈(bufalin)對低分化鼻咽癌(CNE - 2Z)細胞氯通道的激活作用以及通道的特性。方法采用全細胞膜片鉗技術記錄蟾蜍靈激活CNE - 2Z細胞膜電流并分析其電流特征。結果細胞外灌流1 μmol/L 的蟾蜍靈可誘發CNE - 2Z細胞產生一個氯電流，該電流潛伏期較長，為(12.1 ± 6.4)min, 其翻轉電位接近氯離子平衡電位。該電流具有較明顯的外向優勢，沒有明顯的時間依賴性失活和電壓依賴性失活。氯通道阻斷劑他莫昔芬(tamoxifen)可完全抑制該電流， 細胞外灌流高滲液也可完全抑制該電流。結論蟾蜍靈可以激活CNE - 2Z細胞氯通道產生氯電流，與容積激活性氯電流相比，該電流的潛伏期較長，并且有更明顯的外向優勢。

蟾蜍靈； 鼻咽腫瘤； 氯通道

蟾蜍靈(bufalin)是中藥蟾酥的有效成分之一，主要從中華大蟾蜍的皮膚和耳后腺提取和分離。研究結果表明, 蟾蜍靈結構與洋地黃極其相似，具有抑制細胞膜上Na+-K+-ATP酶活性，使胞內Ca2+濃度升高，具有升壓、強心等作用。近年研究發現，蟾蜍靈能夠抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期[1]及誘導細胞凋亡[2]。

我們前文報道，容積激活性氯通道在細胞增殖、細胞周期及凋亡等生命活動中起重要作用，氯通道阻斷劑能抑制細胞增殖，阻滯細胞周期及阻抑抗腫瘤藥順鉑誘導的細胞凋亡[3-5]。目前，關于蟾蜍靈對細胞膜離子通道作用方面的相關報道甚少。本實驗擬在前期研究的基礎上，用全細胞膜片鉗方法記錄蟾蜍靈對低分化鼻咽癌細胞(CNE - 2Z)的氯電流，并分析該電流的特征，為從離子通道的角度了解蟾蜍靈抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期及誘導細胞凋亡的機制提供新的實驗依據。

材 料 和 方 法

1細胞培養

低分化鼻咽癌上皮細胞(CNE - 2Z)用含10 % 小牛血清、1×105U /L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPMI- 1640生長液常規培養在細胞培養瓶內，置于37 ℃、飽和濕度、5 % CO2培養箱中。隔天傳代，操作在培養室超凈工作臺內進行。

2灌流液

等滲灌流液(isotonic solution,Iso)滲透壓為300 mOsmol/L，含(mmol/L) : 70 NaCl，0.5 MgCl2，2 CaCl2, 10N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid (HEPES)和140 D- mannitol。47%高滲灌流液(hypertonic solution，Hyper)滲透壓為440 mOsmol/L，除溶液中D - mannitol為280 mmol/L 外, 其余成份和等滲液相同。灌流液用三羥甲基氨基甲烷(Tris base)緩沖液調pH值至7.4，用冰點滲透壓計(osmomat030,Gonotec) 檢測滲透壓。

3試劑

蟾蜍靈由暨南大學藥學院提供，用二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)配制成20 mmol/L 儲存液，在- 4 ℃ 保存。他莫昔芬購自Sigma，實驗前用甲醇將他莫昔芬配制成50 mmol/L 原液，在臨用前用灌流液將蟾蜍靈和他莫昔芬分別稀釋至1 μmol/L 和20 μmol/L。

4膜片鉗實驗

4.1電極內液 電極內液含(mmol/L): 70 N -methyl - D - glucamine chloride (NMDG - Cl)，1.2 MgCl2，10 HEPES，1 ethylene glycol bis(2-aminoethyl) tetraacetic acid (EGTA)，140 D - mannitol 和2 adenosine - triphosphate (ATP)。用Tris base緩沖液調pH至7.25,用D - mannitol 調滲透壓至300 mOsmol/L，過濾除菌后分裝，于- 20 ℃ 保存, ATP在實驗前加入。

4.2全細胞膜片鉗記錄 CNE-2Z細胞按常規用0.25 %胰酶消化后，將吹打成的單細胞混懸液接種在22 mm 小玻片上，置37 ℃、5 % CO2培養箱中培養1 h 后，取出玻片置于特制圓形灌流槽中做全細胞膜片鉗實驗。用EPC - 7膜片鉗放大器(List Electronic)記錄單個的CNE-2Z細胞全細胞電流。記錄電極使用硼硅酸鹽毛細玻璃管,在微電極拉制器( PB-7)上分2步拉制成微電極，充注電極內液后的微電極尖端電阻約5-10 MΩ。電流和電壓信號用CED 1401(Cambridge)數字化(采樣頻率3 kHz) ,實驗數據用EPC (CED, Cambridge)軟件分析。根據細胞膜電容和全細胞電流大小，求出標準化后的全細胞電流密度(pA/pF)。鉗制電壓模式:細胞被鉗制在氯平衡電位，由EPC軟件包產生指令，以0 mV、±40 mV和±80 mV順序循環往復，每一電位持續200 ms，兩電位之間間隔4 s。所有實驗在室溫下(20 ℃- 24 ℃)進行。

4.3蟾蜍靈激活氯電流 將細胞玻片安放在灌流槽中，全細胞記錄形成并測定細胞電容之后，先繼續用等滲灌流液灌流2-3 min,記錄穩定的基礎電流，然后加入含1 μmol/L 蟾蜍靈的等滲灌流液以激活電流，并記錄激活電流的潛伏期(基礎電流強度值從開始灌流蟾蜍靈到增大1倍所需的時間)。

4.4氯通道阻斷劑抑制氯電流 待蟾蜍靈激活細胞膜電流達到峰值并平穩2 min 后，再加20 μmol/L他莫昔芬,待氯電流被抑制達到最小值并平穩2 min 后,分析和計算氯通道阻斷劑他莫昔芬對蟾蜍靈激活的氯電流抑制效應。

4.5蟾蜍靈激活氯電流的容積敏感性 當蟾蜍靈激活細胞電流達到峰值并穩定2 min 后，換為含1 μmol/L 蟾蜍靈的47 %高滲灌流液，觀察細胞容積縮小對蟾蜍靈激活氯電流的影響。

5統計學處理

結 果

1蟾蜍靈緩慢激活CNE-2Z細胞電流

當CNE-2Z細胞浸浴在等滲灌流液中時,細胞膜基礎電流強度很小而且平穩。細胞平均電流密度在+ 80 mV 電壓鉗制下為(5.11 ± 0.81) pA/pF，在- 80 mV電壓鉗制下為(-5.43 ± 0.83) pA/pF(n=8)。

在等滲灌流液中加入1 μmol/L 蟾蜍靈后,可緩慢激活細胞膜離子通道，產生一電流,見圖1，不同細胞電流激活的潛伏期長短不一，差別較大，一般在5 min-15 min范圍內，潛伏期均值為(12.1 ± 6.4)min(n=8)。

Figure 1. The time course of bufalin-activated chloride currents in CNE-2Z cells.Membrane potentials were repeatedly clamped at 0,±40 and±80 mV.

2蟾蜍靈激活電流的特征

如圖2 所示，蟾蜍靈激活的電流表現為外向優勢，無明顯時間依賴性和電壓依賴性失活。當電流緩慢增加至峰值并穩定時，其外向電流密度在+80 mV電壓鉗制下為(42.06 ± 5.88) pA/pF，內向電流在-80 mV 電壓鉗制下為(22.77 ± 2.73) pA/pF,見圖3，外向電流比內向電流大80 %左右，內外向電流密度差異顯著(Plt;0.01)。

因為灌流液和電極內液中均不含有K+，而Na+和Ca2+在實驗條件下的平衡電位超過+ 200 mV，而蟾蜍靈激活電流的翻轉電位為(- 7.98 ± 1.43)mV，見圖3，接近本實驗條件Cl-平衡電位的理論值(- 0.9 mV)，且在不同鉗制電壓下的電流方向與Cl-運動的方向一致，因此提示蟾蜍靈誘導CNE-2Z細胞的電流是氯電流。

Figure 2. The typical current traces induced by bufalin in CNE-2Z cells.Membrane potentials were repeatedly clamped at 0,±40 and±80 mV.

Figure 3. The current - voltage ( I - V) relationship of the bufalin - activated current in CNE-2Z cells. ±sE.n=8.**Plt;0.01 vs Iso. Iso: isotonic solution.

3他莫昔芬對蟾蜍靈激活氯電流的抑制作用

他莫昔芬是常用的氯離子通道阻斷劑，可完全抑制47 %低滲灌流液誘導的CNE-2Z 細胞產生容積激活性氯電流。本實驗觀察了細胞外灌流20 μmol/L他莫昔芬對蟾蜍靈激活的氯電流作用，圖4A顯示了他莫昔芬作用于同一細胞前后的電流全過程。結果表明, 20 μmol/L 他莫昔芬可迅速而完全地抑制蟾蜍靈激活的氯電流(Plt;0.01)，在他莫昔芬的作用下，蟾蜍靈激活的外向細胞電流密度峰值從(42.06 ± 5.88) pA/pF迅速減少至(2.58 ± 0.98) pA/pF(+80 mV)，內向電流密度峰值從(-22.77 ± 2.73) pA/pF快速下降至 (-2.52 ± 0.34) pA/pF(-80 mV)，見圖4B。本結果進一步證實蟾蜍靈激活的電流是一個氯通道介導的氯電流。

4蟾蜍靈激活氯電流的容積敏感性

當等滲灌流液加入1 μmol/L 蟾蜍靈后, 細胞膜氯通道開放，氯電流增大，見圖5A。而當膜電流增加至峰值并穩定后, 再換為含蟾蜍靈的47 %高滲灌流液, 細胞發生皺縮,細胞容積縮小，可見電流顯著減小，見圖5B，表明蟾蜍靈誘導的Cl-電流對細胞容積變化敏感。

Figure 4. Inhibition of bufalin-activated Cl- currents by the chloride channel blocker tamoxifen in CNE - 2Z cells.A: the time course of inhibition of bufalin-activated chloride currents by tamoxifen; B:the mean currents recorded before (control) and after treatment with bufalin alone or with bufalin plus tamoxifen±sE.n= 8.**P lt; 0.01 vs bufalin.

Figure 5. Inhibition of bufalin-activated Cl- currents by the cell shrinkage induced by extracellular hypertonic shocks.A: current traces recorded in the isotonic solution containing bufalin; B: current traces recorded in 47 % hypertonic solution containing bufalin.

討 論

蟾蜍靈是從動物蟾蜍的皮膚和耳后腺提取和分離、被認為具有地高辛樣免疫活性的成分,也是目前臨床用于治療肝癌、胰腺癌等腫瘤的藥物華蟾素注射液的有效成分之一。蟾蜍靈能夠抑制細胞膜上Na+-K+-ATP酶,使細胞內Na+濃度升高，進而促發Na+-Ca2+交換，增加細胞內Ca2+濃度。而Ca2+作為細胞內第二信使，其濃度升高后可通過進一步激活蛋白激酶或離子通道等方式，產生以靶蛋白構象變化為基礎的級聯反應和細胞功能改變。目前多數文獻認為蟾蜍靈抑制腫瘤細胞增殖主要與誘導細胞分化[6]、阻滯細胞周期及誘導腫瘤細胞凋亡[1,7]有關，但其作用機制尚未完全清楚。

我們前期的研究表明，容積激活性氯通道是在細胞外低滲或細胞內高滲而導致細胞腫脹時被激活，氯離子外流，伴隨水的外流，這是細胞調節性容積回縮的主要機制之一[8]。在等滲狀態下，容積激活性氯離子通道和細胞容積改變參與調節細胞增殖、細胞周期及細胞凋亡等生命活動。例如在細胞周期進程中，細胞容積是逐漸增大的，容積改變將影響胞內包括參與DNA合成的各種酶等大分子有機物濃度，尤其是在G1/S期轉換點。而細胞可通過不同周期的調節性容積回縮能力改變來調節和維持細胞容積平衡[3]，參與細胞周期進程調節。使用氯通道阻斷劑他莫昔芬、三磷酸腺苷和5-硝基-2-(3-苯丙胺基)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpro-pylamino) benzoic acid，NPPB]可以抑制鼻咽癌細胞增殖，阻滯細胞周期，并抑制由順鉑誘導的細胞凋亡[5]。蟾蜍靈能抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期及誘導細胞凋亡，但氯通道是否為蟾蜍靈作用的靶點，目前尚未清楚。

本研究用全細胞膜片鉗的方法，直接觀察在等滲狀態下蟾蜍靈對CNE-2Z細胞氯離子通道的作用。實驗結果表明，細胞外灌流蟾蜍靈可以緩慢激活1個氯電流，該電流在不同鉗制電壓下其電流方向和Cl-運動方向一致，其翻轉電位接近Cl-的平衡電位，該電流可被氯通道阻斷劑他莫昔芬完全抑制，細胞外高滲導致細胞皺縮可使該通道關閉，Cl-外流顯著減少。本實驗結果表明蟾蜍靈激活的是氯通道介導的氯電流，該電流的部分特征與我們前文報道的容積激活性氯電流相似[9]，如具有外向優勢及無明顯時間依賴性失活和電壓依賴性失活,對細胞容積縮小敏感等。但與細胞外低滲激活的容積激活性氯電流相比，蟾蜍靈激活氯電流的潛伏期更長，外向優勢更明顯,外向電流比內向電流增大約80%。CNE-2Z細胞容積激活性氯電流的潛伏期為1 min-2 min, 不同細胞的潛伏期差別較小[9]，而蟾蜍靈激活氯電流的潛伏期長達10多分鐘，且不同細胞的潛伏期差別較大。

雖然蟾蜍靈激活的氯電流和容積激活性氯電流部分特征相似，但兩者激活的條件不同，容積激活性氯電流是在低滲環境中被激活，而蟾蜍靈激活的氯電流卻是在等滲環境中產生，而且產生電流的潛伏期較長，這提示蟾蜍靈激活氯通道和低滲激活氯通道的類型和途徑可能不完全相同。Na+-K+-ATP酶對維持細胞滲透壓和細胞容積穩定有重要作用[10]，蟾蜍靈能抑制其活性，使胞內Na+濃度升高，同時，由于胞內膜電位負值減少，胞外Cl-內流，使胞內Cl-濃度增加。胞內Na+、Cl-濃度增加，可使胞漿滲透壓升高，這可能會引起細胞容積增大從而激活容積激活性氯通道。此外，蟾蜍靈也可能會在細胞容積不變的等滲狀態下，通過某些途徑直接激活氯通道。蟾蜍靈激活的氯離子通道的分子本質，有待進一步的探討。

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Bufalinactivateschloridechannelsinpoorlydifferentiatednasopharyngealcarcinomacells

LUO Hai-bing1, LI Hua-rong2, LIU Shan-wen2, PENG Shuang2, LIU Zhen- feng2, YE Wen-cai3, ZHANG Dong-mei3, CHEN Li-xin2, WANG Li-wei2

(1DepartmentofPhysiology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023,China;2SchoolofMedicine,3CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:wangliweic@sohu.com;chenlixinw@sohu.com)

AIM: To investigate the activation of chloride channels induced by bufalin and the properties of the channels in poorly differentiated nasopharyngeal carcinoma (CNE-2Z) cells.METHODSThe technique of whole-cell patch clamp was used to record the chloride currents and to analyze the characteristics of the currents in CNE-2Z cells.RESULTSA chloride current was slowly activated by extracellular application of bufalin (1 μmol/L). The activation of the current was slower than that of the volume-activated chloride current, with an activation latency of(12.1±6.4) min. The reversal potential of the current was close to the calculated Cl-equilibrium potential (ECl= - 0.9 mV). The chloride current was outward-rectified and did not show significant time-dependent or voltage-dependent inactivation. The chloride channel blocker tamoxifen completely inhibited the outward and inward currents. The current was also completely inhibited by extra-cellular application of 47% hypertonic solution.CONCLUSIONBufalin activates chloride channels and induces a chloride current in CNE-2Z cells. Compared with the volume-activated chloride current in CNE-2Z cells, the activation latency of the bufalin-induced current is longer and the outward rectification is more obvious.

Bufalin; Nasopharyngeal neoplasms; Chloride channels

1000-4718(2011)04-0672-05

R739.63

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.010

2010-12-30

2011-02-24

國家自然科學基金資助項目 (No.30771106; No.30870567; No. 30871267; No.90913020; No.U0932004)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 07005974)；廣東醫學院青年基金資助項目(No.XQ06013)。

△通訊作者 王立偉 Tel: 020-85220260;E-mail: wangliweic@sohu.com; 陳麗新 Tel: 020-85228865;E-mail: chenlixinw@sohu.com