EDRV和DIDS對急性缺血再灌注心肌組織活性氧水平的影響*

劉艷霞， 劉佳妮， 沈明志， 李 榕， 張榮懷， 翟雅莉， 趙 萌， 王躍民， 王曉明△

(第四軍醫大學1西京醫院老年病科，2生理學教研室,陜西 西安710032)

EDRV和DIDS對急性缺血再灌注心肌組織活性氧水平的影響*

劉艷霞1， 劉佳妮1， 沈明志1， 李 榕1， 張榮懷1， 翟雅莉1， 趙 萌1， 王躍民2， 王曉明1△

(第四軍醫大學1西京醫院老年病科，2生理學教研室,陜西 西安710032)

4, 4’-二異硫氰基芪-2, 2’-二磺酸； 再灌注； 活性氧；依達拉奉；心臟

心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injuury,I/RI)的主要機制是活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的產生，其主要來源于線粒體的黃嘌呤氧化酶、吞噬細胞和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotine adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH oxidase)[1]。ROS是誘導組織細胞損傷性死亡的關鍵分子。研究表明：用抗氧化劑治療或者上調內源性抗氧化酶可以保護再灌注引起的損傷；轉基因小鼠中的抗氧化蛋白質超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ,SOD)的高表達時心肌梗死面積可顯著減少[2]。我們前期研究發現，氯離子通道阻斷劑 4,4’-二異硫氰基芪-2,2’-二磺酸( 4,4’- diisothiocyanostilbene-2, 2’-disulfonic acid ,DIDS)具有減輕心臟I/RI的作用[3-5]，且發現DIDS 、自由基清除劑依達拉奉(edaravone,EDRV)及兩者聯合使用均具有保護心肌的作用，那么，他們是通過什么途徑起作用的？對組織中ROS有調節作用嗎？作用機制如何？為此，本研究進行了上述問題的實驗觀察。

材 料 和 方 法

1材料

2方法

2.1心肌I/RI模型的制備及實驗方案 將SD大鼠以30 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg)經腹腔注射麻醉后，按常規方法制備大鼠I/RI(30 min/4 h)模型[6]：頸正中切口氣管插管，連接呼吸機進行正壓人工呼吸，經右頸總動脈插管至左心室記錄左室壓及其微分。開胸暴露心臟，結扎左冠狀動脈前降支起始段，以心電圖上ST段抬高或T波高聳、心肌顏色變暗紅色為結扎成功的標志。缺血30 min后，松開絲線，再灌注4 h。將40只SD大鼠隨機分為5組：假手術(sham)組、心肌I/RI組、DIDS(I/RI+DIDS)組、EDRV組(I/RI+EDRV)組和DIDS+EDRV(I/RI+DIDS+EDRV)組，每組8只大鼠。于再灌注前，將EDRV按10 mg/kg經右頸動脈注入，持續注入時間為5 min[7]。于再灌注即刻,經股靜脈以程控微量泵給予DIDS(14 mg/kg,4 mL·kg-1·h-1),持續2 h[3]。

2.2心肌細胞凋亡測定 用TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測各組心肌組織中的凋亡細胞，嚴格按試劑盒說明書操作，樣本切片在 1 h 內(避免熒光淬滅)于熒光顯微鏡下觀察。本實驗采用 Hoechst 33342 對全部細胞核進行襯染。

2.3血清SOD活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的檢測 再灌注 4 h 結束時,從大鼠右側頸總動脈取血 2 mL,室溫放置30 min 后,3 000 r/min 離心20 min后用移液器取上清分裝在 EP 管中，盡量避免傾倒，液氮速凍，-20 ℃ 冰箱保存。按照試劑盒說明書操作，用分光光度計檢測SOD 活性及 MDA 含量。

3統計學處理

結 果

1心肌細胞凋亡測定

TUNEL法檢測不同組大鼠I/R 4h心肌細胞凋亡指數結果見圖1、表1。與sham組相比，其它 4 組心肌細胞凋亡指數顯著高于sham組(Plt;0.05)；與I/RI組相比，DIDS組、EDRV組與DIDS + EDRV組的心肌細胞凋亡均明顯降低(Plt;0.05)，DIDS和EDRV組間無顯著差異(Pgt;0.05)，DIDS + EDRV組較DIDS或EDRV組有明顯降低(Plt;0.05)，可見DIDS和EDRV均具有抑制心肌細胞凋亡發生的作用，聯合使用時，其抑制作用強于二者單獨使用。

Figure 1. Effects of EDRV or/and DIDS on myocardial apoptosis in acute ischemia- reperfusion injury.

表1 DIDS和EDRV及二者聯合使用對大鼠心肌細胞凋亡的影響

2血清SOD活性及MDA含量的檢測

不同組大鼠I/RI 4 h血清SOD活性及MDA含量見圖2、3，I/RI 組、DIDS 組、EDRV 組及 DIDS + EDRV 組血清中 SOD 活性較sham 組明顯降低，但 MDA 含量較 sham 組明顯增加(Plt;0.05)；與 I/RI 組比，DIDS 組、EDRV 組及 DIDS + EDRV 組血清中 SOD 活性均明顯增加(Plt;0.05)，但MDA 含量均明顯降低(Plt;0.05)； DIDS 組與 EDRV 組相比，DIDS 組的 SOD 活性降低更顯著(Plt;0.05), 但MDA 含量增高更顯著(Plt;0.05)；而DIDS + EDRV組與 EDRV 組相比，DIDS + EDRV 組的 SOD 活性明顯增高，但MDA 活性明顯降低，但均無顯著差異(Pgt;0.05)。

Figure 2. Effects of EDRV and DIDS on serum SOD activity after acute ischemia- reperfusion injury ±sE. n=8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 3. Effects of EDRV and DIDS on serum MDA concentration after acute ischemia- reperfusion injury ±sE. n =8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 4. Effects of EDRV and DIDS on ROS concentration in myocardial tissues after acute ischemia- reperfusion injury±sE. n =8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 5. Effects of EDRV and DIDS on superoxide anion concentration in myocardial tissues after acute ischemia- reperfusion injury±sE. n=8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 6. Effects of EDRV and DIDS on hydroxy free radical (OH·) concentration in myocardial tissues after acute ischemia- reperfusion injury±sE.n=8.*Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

討 論

氯離子是體內最豐富的陰離子，其調節主要受細胞膜上特異通道蛋白的功能性改變相關，它參與了調節細胞的增殖、發育、凋亡及細胞容積的變化等重要生理功能。我們前期從細胞及整體動物水平已經證實了氯離子通道阻斷劑DIDS能夠抑制I/RI心肌細胞的凋亡及改善心臟功能[3-5,9]，其保護心肌細胞與激活PI3K/Akt信號通路有關[4， 5]。眾多研究證實I/RI是缺血性心血管疾病血管再通后加重組織器官損傷的主要機制，而活性氧的產生是引起細胞損傷的主要啟動因子[1]。Qin等[8]報道梗死后心肌缺血/再灌注損傷與壞死區周圍組織中細胞凋亡密切相關，用抗氧化劑治療或者上調內源性抗氧化酶可有效保護再灌注引起的心肌損傷。同時，我們前期的研究也證實：在急性缺血/再灌注大鼠模型的再灌注前給予 ROS 清除劑-EDRV，能夠改善心臟功能，減小缺血/再灌注損傷心肌凋亡的發生，進一步證明了活性氧簇在心臟缺血/再灌注損傷中的重要作用。

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EffectsofEDRVandDIDSonreactiveoxygenspecieslevelsinacuteischemia-reperfusioninjuredmyocardium

LIU Yan-xia1, LIU Jia-ni1, SHEN Ming-zhi1, LI Rong1, ZHANG Rong-huai1, ZHAI Ya-li1, ZHAO Meng1, WANG Yue-min2, WANG Xiao-ming1

(1DepartmentofGeriatrics,XijingHospital,2DepartmentofPhysiology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:xmwang@fmmu.edu.cn)

4,4’-diisothiocyanostilbene-2, 2’-disulfonic acid; Reperfusion; Reactive oxygen species; Edaravone; Heart

1000-4718(2011)04-0648-05

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.005

2010-10-02

2011-02-16

國家自然科學基金資助項目 (No.30770847; No.81070127)

△通訊作者 Tel:029-84775543;E-mail:xmwang@fmmu.edu.cn