CXCR4抑制劑AMD3100對2型登革熱病毒誘導血管內皮細胞株Eahy926凋亡的影響*

龍喜貴， 李 穎， 鄭毅濤， 齊一鳴， 黃俊琪

(中山大學中山醫學院免疫教研室，免疫學研究所，教育部熱帶病防治研究重點實驗室, 廣東 廣州 510080)

CXCR4抑制劑AMD3100對2型登革熱病毒誘導血管內皮細胞株Eahy926凋亡的影響*

龍喜貴， 李 穎， 鄭毅濤， 齊一鳴， 黃俊琪△

(中山大學中山醫學院免疫教研室，免疫學研究所，教育部熱帶病防治研究重點實驗室, 廣東 廣州 510080)

目的探討趨化因子受體CXCR4抑制劑AMD3100對2型登革熱病毒(DV2)誘導人臍靜脈血管內皮細胞株 Eahy926凋亡的影響。方法免疫組織化學法檢測Eahy926細胞的Ⅷ因子。Eahy926細胞分成未感染組和DV2感染組，流式細胞術檢測兩組細胞不同時點(24 h、36 h、48 h和60 h)CXCR4的表達水平。流式細胞術分析未感染組、DV2感染組及DV2+AMD3100組不同時點的細胞凋亡率。免疫熒光法檢測細胞膜表面磷脂酰絲氨酸(PS)。結果Eahy926細胞有Ⅷ因子表達。在DV2感染Eahy926后的4個時點中，CXCR4的表達均有上調，其中以48 h感染組最明顯(66.13%±10.30%，Plt;0.05)。DV2感染能誘導Eahy926細胞凋亡，其中36 h感染組凋亡率出現高峰(29.85%±15.78%，Plt;0.05)。應用AMD3100后在各時點均能上調DV2感染組的凋亡率，免疫熒光觀察到DV2感染組及DV2+AMD3100組綠色熒光標記的細胞增多。結論DV2感染能誘導血管內皮細胞Eahy926凋亡并上調CXCR4的表達，CXCR4抑制劑AMD3100促進DV2誘導Eahy926細胞凋亡的發生。

登革熱病毒; 凋亡; 受體,CXCR4; 血管內皮細胞

登革熱病毒(dengue virus, DV)，登革熱( dengue fever, DF)的病原體，已經成為重要的人類蟲媒病毒，威脅到熱帶和亞熱帶超過100個國家的25億人口[1]。普遍認為2型登革熱病毒(dengue virus type 2, DV2)流行最廣，毒力較強，可引起重癥DF，即登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome, DSS)，其主要的特征是血漿滲漏。有報道表明DV引起的宿主細胞凋亡在其致病機制中發揮了重要作用[2]。我們前期研究表明，DV2可通過Fas/FasL途徑誘導原代人臍靜脈內皮細胞(human umbilical veins endothelium cells，HUVECs)產生凋亡[3]。在后續研究中我們又發現DV2感染HUVECs后趨化因子受體CXCR4(C-X-C motif chemokine receptor 4)的基因水平表達增加。CXCR4是人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus，HIV)感染的輔助受體，與血管生成密切相關[4]，但其在DV感染血管內皮細胞中的作用尚未明確。本研究采用流式細胞術檢測人臍靜脈內皮細胞株Eahy926感染DV2前后CXCR4 的表達，并研究CXCR4特異性抑制劑AMD3100對DV2誘導Eahy926細胞凋亡率的影響，探索CXCR4在DV2感染血管內皮細胞中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞系 Eahy926 是由人肺腺癌細胞株A549與原代培養的人臍靜脈血管內皮細胞融合構建而成的永生化細胞株，具有血管內皮細胞的特性[5]，為中山醫學院干細胞與組織工程研究中心惠贈。

1.2病毒 DV2病毒株(new guinea Cstrain)來自中山醫學院微生物學教研室， 本實驗室已進行病毒擴增和定量保存。

1.3主要試劑 DMEM/F12培養基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗等為Gibco產品。凋亡檢測試劑盒為南京凱基(含FITC-AnnexinⅤ組份)產品，CXCR4流式抗體為BD產品，Ⅷ因子Ⅰ抗為Thermo產品，Ⅱ抗為上海基因科技產品。

2方法

2.1細胞培養 Eahy926 用100 mL/L胎牛血清及青鏈霉素雙抗為1.0 ×105U/L DMEM/F12培養液， 37 ℃、5%CO2孵育箱中培養。

2.2Ⅷ因子染色 取對數期生長的Eahy926細胞，經4%多聚甲醛固定20 min后，0.2%Triton打孔10 min，3%H2O2處理10 min，5%BSA封閉20 min，加抗Ⅷ因子 Ⅰ 抗，37 ℃ 60 min，Ⅱ 抗37 ℃ 30 min，DAB顯色。

2.3登革病毒感染及抑制劑應用 取已定量好的2 型登革病毒液( 109PFU/L) 加入Eahy926 細胞培養板中吸附2 h，棄去上清，加入培養液，應用抑制劑AMD3100(1 mg/L)于感染2 h后棄去多余病毒時，加入培養基，37℃、5%CO2培養，在各時點棄去培養液, 收集細胞。CXCR4的流式細胞術檢測分4個時間點(24 h、36 h、48 h和60 h)，每個時點設未感染組和DV2感染組。Eahy926的凋亡檢測時點設置同CXCR4檢測，每時點設未感染組、DV2感染組及DV2+AMD3100組，病毒及試劑濃度參照文獻[6]。

2.4流式細胞術檢測Eahy926細胞的CXCR4表達 取對數期生長的Eahy926 細胞,500×g離心5 min， 用PBS 洗滌2 遍。用buffer重懸并調整細胞數為1×109cells/L 吸取100 μL 轉移至5 mL 的流式離心管中，加CXCR4的流式抗體12 μL，室溫孵育30min， PBS 洗滌2遍后用buffer 200 μL重懸，流式細胞儀檢測。

2.5流式細胞術檢測Eahy926細胞的凋亡 取對數期生長的Eahy926 細胞離心，500×g離心5 min，用PBS 洗滌2 遍。用binding buffer 重懸并調整細胞數為1×109cells/L 吸取100 μL 轉移至5 mL 的流式離心管中， 加入FITC-AnnexinⅤ 5 μL、PI 5 μL 混勻， 室溫避光放置15 min，加入binding buffer 400 μL，流式細胞儀檢測。

2.6熒光顯微鏡觀察Eahy926細胞表面的磷脂酰絲氨酸(PS) 細胞經DV2刺激及AMD3100處理后，PBS漂洗2次，加含有FITC-AnnexinⅤ的buffer，室溫反應5 min，熒光顯微鏡下觀察。

3統計學處理

結 果

1Eahy926細胞Ⅷ因子染色呈陽性

Eahy926細胞經內皮細胞特性Ⅷ因子染色后出現棕黃色的陽性反應，見圖1，證實其具有內皮細胞的特性。

Figure 1. Immunohistochemistry staining of factor Ⅷ in Eahy926 cells(DAB staining,×200).

2DV2感染上調了Eahy926的CXCR4表達

Eahy926細胞未感染組設4個時點(24 h、36 h、48 h和60 h)，各時點表面表達CXCR4的Eahy926細胞百分比分別是:47.23% ±17.85%、 55.90%±11.48%、45.65%±20.93%和46.23%±21.47%。DV2感染Eahy926細胞各個相應時點細胞表面CXCR4表達的百分比分別為52.90%±16.28%，58.93%±11.3%， 66.13%±10.30%，46.23%±21.47%，與感染前比均上升，其中48 h組感染前后差異最明顯(Plt;0.05,n=3) ，見圖2、3。

Figure 2. Expression of CXCR4 in Eahy926 cells before or after DV2 infection at 24 h, 36 h, 48 h and 60 h detected by flow cytometry.

Figure 3. CXCR4 expression in Eahy926 cells before or after DV2 infection at 24 h, 36 h, 48 h and 60 h .±s.n=3 *Plt;0.05 vs untreated cells

3DV2感染與應用AMD3100后增加了Eahy926的凋亡率

圖4結果顯示DV2感染組4個時點(24 h、36 h、48 h和60 h)Eahy926細胞凋亡率分別為：25.18% ±8.82%、29.85% ±15.78%、19.95% ±4.96%和29.29% ±10.08%，均高于未感染組的Eahy926細胞凋亡率(18.95% ±9.00%、22.92% ±13.06%、18.91%±2.37%和25.73% ±9.35%)。而DV2+AMD3100組各時點Eahy926細胞凋亡率為39.39% ±15.94%、30.45% ±16.88%、27.46% ±8.26%和36.37% ±18.86%。48 h DV2+AMD3100組Eahy926細胞凋亡率高于DV2相應時點組(Plt;0.05,n=3)，見圖4、 5。

Figure 4. Apoptosis of Eahy926 cells treated with or without AMD3100 before or after DV2 infection at 24 h,36 h,48 h and 60 h detected by flow cytometry.

Figure 5. Apoptosis of Eahy926 cells treated with or without AMD3100 24 h, 36 h, 48 h and 60 h after DV2 infection±s.n=3. *Plt;0.05 vs untreated group; △Plt;0.05 vs DV2 group.

4免疫熒光法檢測發現DV2感染組和DV2+AMD3100組Eahy926細胞表面磷脂酰絲氨酸表達增多

結果顯示未感染組綠色熒光標記的磷脂酰絲氨酸極少，DV2感染組及DV2+AMD3100組綠色熒光標記的細胞增多，見圖6。

討 論

細胞凋亡(apoptosis) 或細胞程序性死亡( programmed cell death, PCD)在維持機體正常發育、清除病毒感染細胞、腫瘤細胞等有著極其重要的意義。Clarke等[7]認為呼腸病毒引起的細胞凋亡可能是由腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體 (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL) 介導的， Kim等[8]研究表明HIV病毒可上調獲得性免疫缺陷綜合征 (acquired immune deficiency syndrome,AIDS) 易感病人體內抗原提呈細胞的TRAIL從而介導凋亡，Larochelle等[9]曾報道EB病毒 (Epstein-Barr virus,EBV)引起細胞凋亡可能是FasL的作用，我們研究發現DV2感染原代HUVECs可通過Fas/FasL途徑誘導凋亡的發生[3]，HUVECs感染DV2后CXCR4的基因水平表達增加。

Figure 6. Direct immunofluorescence staining of phosphatidylserine in Eahy926 cells with FITC-Annexin V(×100)

為了進一步研究CXCR4在DV2感染血管內皮細胞中的作用，我們選擇人靜脈血管內皮細胞株Eahy926細胞作為細胞模型。Eahy926細胞來源于HUVECs[5]，與原代HUVECs相比易于培養且無原代細胞分離培養過程中雜細胞的影響。但Eahy926細胞在長期不斷傳代培養后是否依然具有內皮細胞特性？我們對其進行了內皮細胞特性Ⅷ因子染色，證實了這一點。

CXCR4是基質細胞衍生因子-1 (stromal cell derived factor 1,SDF-1)的特異性受體[10]，屬于7次跨膜的G蛋白偶聯受體家族。CXCR4與配體SDF-1結合傳遞的細胞間信號在造血干細胞歸巢、淋巴細胞遷移、促腫瘤細胞侵襲[11]、促血管細胞增殖生長[ 12,13]等方面發揮著重要作用。有報道表明下調CXCR4的表達抑制了腫瘤細胞的代謝和侵襲性[14]，增加CXCR4的表達抑制了過敏性紫癜血小板的自身凋亡[15]。有報道應用CXCR4的單克隆抗體或其特異性的抑制劑AMD3100可上調Fas等凋亡相關因子的表達[16]。AMD3100是SDF-1受體CXCR4的非肽類阻斷劑，能特異性與CXCR4結合而不產生激動作用，阻斷SDF-1/CXCR4軸參與的生理過程。本文初步研究了AMD3100對DV2誘導血管內皮細胞Eahy926凋亡的影響。

本實驗結果顯示DV2感染Eahy926細胞后能上調CXCR4的表達，48 h升高最為明顯。根據SDF-1/CXCR4軸參與的生理過程，其CXCR4于感染后表達增加可能為DV2誘導Eahy926細胞凋亡后的保護性上調。DV2感染可以誘導Eahy926細胞凋亡，其中36 h凋亡率增高最為明顯；AMD3100能上調DV2誘導的Eahy926細胞的凋亡率，48 h DV2感染組與DV2+AMD3100組凋亡率存在顯著差異，其原因可能為48 h時點CXCR4的表達增加最為明顯，從而AMD3100對SDF-1/CXCR4軸產生的抑制作用也會更加明顯。綜上可以看出AMD3100在DV2感染血管內皮細胞株Eahy926中可以促進病毒誘導的細胞凋亡的發生，但其作用機制還有待進一步研究。

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EffectofAMD3100ondenguevirustype2-inducedapoptosisinEahy926cells

LONG Xi-gui, LI Ying, ZHENG Yi-tao, QI Yi-ming, HUANG Jun-qi

(DepartmentofImmunology,InstituteofImmunology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYet-senUniversity,KeyLaboratoryofTropicalDiseaseControl,MinistryofEducation,Guangzhou510080,China.E-mail:junqi_huang@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the role of AMD3100 (an inhibitor of CXCR4) in dengue virus type 2 (DV2)-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cell line Eahy926.METHODSThe expression of factor Ⅷ in Eahy926 cells was examined by immunohistochemistry staining. The cells were divided into untreated group, DV2 infection group and DV2+AMD3100 group. Flow cytometric analysis was used to detect the expression of CXCR4 in Eahy926 cells 24 h, 36 h, 48 h and 60 h after DV2 infection. In addition, the percentage of apoptotic cells was also analyzed by flow cytometry. Immunofluorescence was performed to detect the phosphatidylserine (PS) on the surface of Eahy926 cells.RESULTSEahy926 cells were factor Ⅷ-positive. Compared with untreated group, the expression of CXCR4 increased in DV2 infection group, most markedly 48 h after infection (66.13%±10.30%,Plt;0.05). The percentage of apoptotic Eahy926 cells after DV2 infection was the highest at 36 h (29.85%±15.78%,Plt;0.05). The percentage of DV2-induced apoptotic cells in DV2+AMD3100 group was higher than that in DV2 infection group. The green fluorescence-labeled cells in DV2 infection group and DV2+AMD3100 group were more than those in untreated group.CONCLUSIONDV2 infection induces apoptosis and increases the expression of CXCR4 in Eahy926 cells. AMD3100, the inhibitor of CXCR4, may be a promoter of apoptosis in Eahy926 cells after DV2 infection.

Dengue virus; Apoptosis; Receptors,CXCR4; Vascular endothelial cells

1000-4718(2011)04-0632-06

R373.33

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.002

2010-09-05

2011-02-24

國家自然科學基金資助項目(No. 30872350;No. 30400371;No. 30571736 )；廣東省自然科學基金資助項目(No.8151008901000017)；廣東省團隊項目(No. 06201946)；廣東省科技計劃項目(No.2007B031516008；No. 2010B050700008)；廣州市科技計劃項目(No. 2006Z3-E4081; No.2008Z1-E221)；高校基本科研業務費中山大學青年教師培育項目(No.10YKPY31)

△通訊作者Tel: 020-87330068-838;E-mail: junqi_huang@yahoo.com.cn