人著色性干皮病D組基因?qū)Π准?xì)胞介素-6促進(jìn)人血管平滑肌細(xì)胞增殖作用的影響*

丁 浩， 李菊香， 洪 葵， 孫國(guó)芳， 張 南， 吳延慶， 吳清華， 程曉曙

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006)

·論著·

人著色性干皮病D組基因?qū)Π准?xì)胞介素-6促進(jìn)人血管平滑肌細(xì)胞增殖作用的影響*

丁 浩， 李菊香△， 洪 葵， 孫國(guó)芳， 張 南， 吳延慶， 吳清華， 程曉曙

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006)

目的探討人著色性干皮病D組基因(XPD)對(duì)白細(xì)胞介素-6(IL-6)促進(jìn)人血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖作用的影響。方法用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD和空質(zhì)粒pEGFP-N2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VSMCs，然后給予1×105U/L IL-6孵育48 h。實(shí)驗(yàn)分為6組：(1)空白對(duì)照組；(2)pEGFP-N2組；(3)pEGFP-N2/XPD組；(4)IL-6組；(5)IL-6 + pEGFP-N2組；(6)IL-6 + pEGFP-N2/XPD組。用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)情況；用MTT法觀察細(xì)胞增殖活力；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率；用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)XPD、Bcl-2、Bax和野生型P53(wt-P53)表達(dá)量的變化。結(jié)果在熒光顯微鏡下，可在轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD或空質(zhì)粒pEGFP-N2的細(xì)胞中觀察到綠色熒光，即轉(zhuǎn)染成功；MTT結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染抑制了細(xì)胞增殖活力(Plt;0.05)，并能抑制IL-6促進(jìn)VSMCs增殖的作用(Plt;0.05)；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染引起了細(xì)胞G0/G1期增加(Plt;0.05)、S期減少(Plt;0.05)、凋亡率增加(Plt;0.01)，并能抑制IL-6促進(jìn)VSMCs G0/G1期減少、S期增加、凋亡率降低的作用(Plt;0.01)；RT-PCR和Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染使得XPD表達(dá)增高(Plt;0.05或Plt;0.01)，同時(shí)Bcl-2表達(dá)降低，Bax和wt-P53表達(dá)增高(Plt;0.05或Plt;0.01)，并能抑制IL-6促進(jìn)VSMCs的Bcl-2表達(dá)增高、Bax和wt-P53表達(dá)降低的作用(Plt;0.05或Plt;0.01)。結(jié)論XPD能抑制VSMCs增殖并促進(jìn)其凋亡，并能抑制IL-6促進(jìn)VSMCs增殖和降低其凋亡的作用，有望成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)。

著色性干皮病D組基因； 白細(xì)胞介素-6； 血管平滑肌細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

人著色性干皮病D組(xeroderma pigmentosum group D,XPD)蛋白是轉(zhuǎn)錄因子ⅡH(transcription factor ⅡH，TFⅡH)的一個(gè)組份[1]。大量研究發(fā)現(xiàn),XPD除了在TFⅡH介導(dǎo)的核苷酸切除修復(fù)和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮主要作用外,還參與了細(xì)胞的增殖、凋亡、腫瘤的發(fā)生甚至化療藥物抗藥性的產(chǎn)生等多種生理及病理機(jī)制[2,3]。有研究表明，XPD基因能抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[4]。

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，有著較高的致病率和致死率，是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。目前對(duì)AS發(fā)病原因尚未完全確定,可能與年齡、性別、血脂異常、高血壓、吸煙、糖尿病、肥胖、感染等因素有關(guān)[5,6]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)過(guò)度增殖被認(rèn)為是促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素[7]。而且，在AS損傷中，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)起到了刺激VSMCs過(guò)度增殖的作用[8]。為此，本研究將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染VSMCs使得XPD高表達(dá)，并給予IL-6處理，然后觀察VSMCs增殖和凋亡的變化，以探討XPD對(duì)IL-6促進(jìn)VSMCs增殖作用的影響。

材 料 和 方 法

1材料

人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株(human umbilical artery smooth muscle cells，HUASMCs)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心；培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清購(gòu)自Hyclone；重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD和空載質(zhì)粒pEGFP-N2由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化疾病研究所張吉翔教授惠贈(zèng)，pEGFP-N2/XPD已通過(guò)PCR反應(yīng)、酶切及基因測(cè)序三重鑒定；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000和TrizolTM購(gòu)自Invitrogen；IL-6購(gòu)自Peprotech；MTT購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)有限公司；DMSO購(gòu)自Amresco；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega；引物由Generay Biotech合成；2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司；Ⅰ抗XPD、Bcl-2、Bax、wt-P53和β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz；Ⅱ抗辣根過(guò)氧化物酶IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和IL-6的處理 將VSMCs置于含10%胎牛血清和雙抗(1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37 ℃、飽和空氣濕度和5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。以2×105cells/well的密度將細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，24 h后細(xì)胞融合率約為90%，質(zhì)粒每孔4.0 μg，脂質(zhì)體每孔10 μL介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后換有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后用含800 mg/L G418的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)有限稀釋法篩選4周獲得2株穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-N2的VSMCs。實(shí)驗(yàn)時(shí)給予終濃度為1×105U/L IL-6孵育48 h[9]。根據(jù)處理因素的不同，實(shí)驗(yàn)分為6組：(1)空白對(duì)照組；(2)pEGFP-N2組；(3)pEGFP-N2/XPD組；(4)IL-6組；(5)IL-6 + pEGFP-N2組；(6)IL-6 + pEGFP-N2/XPD組。孵育結(jié)束后收獲細(xì)胞。在熒光顯微鏡下觀察，熒光顯微鏡激發(fā)光波長(zhǎng)395 nm，觀察pEGFP釋放波長(zhǎng)為508 nm的綠色熒光。

2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 將細(xì)胞種植在96孔板中，每孔1×103個(gè)細(xì)胞，空白調(diào)零孔只加不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)處理后，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入100 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀(Labststems)測(cè)定492 nm處各孔吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率 用胰酶消化收集上述各組細(xì)胞，應(yīng)用FACSCalibar流式細(xì)胞儀(Beckton Dickinson)分析細(xì)胞周期，得出各細(xì)胞周期的百分率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，主要步驟為：用胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，再用500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.4RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞總RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。XPD正義鏈引物5’-TCTGCCTCTGCCCTATGAT-3’，反義鏈引物5’-CGATTCCCTCGGACACTTT-3’，產(chǎn)物為363 bp。Bcl-2正義鏈引物5’-GGTGCCACCTGTGGTCCA-3’，反義鏈引物5’-ACTTGTGGCCCAGATAGG-3’，產(chǎn)物為451 bp。bax正義鏈引物5’-GGATGCGTCCACCAAGAA-3’，反義鏈引物5’-GCACTCCCGCCACAAAGA-3’，產(chǎn)物為386 bp。野生型p53(wild type P53, wt-P53)正義鏈引物5’-CTACAAGCAGTCACAGCACATGAC-3’，反義鏈引物5’-TCATTCAGCTCTCGGAACATCTCG-3’, 產(chǎn)物為551bp。β-actin正義鏈引物5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，反義鏈引物5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，產(chǎn)物大小為285 bp。PCR反應(yīng)體系如下:cDNA 500 ng，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,補(bǔ)去離子水至終體積25 μL。按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)，94 ℃ 5 min；PCR反應(yīng)，35個(gè)循環(huán)，94 ℃ 40 s，退火 40 s,72 ℃ 55 s；延伸，72 ℃ 7 min。退火溫度：XPD 53 ℃，Bcl-2 58 ℃，Bax 54 ℃，wt-P53 57 ℃,β-actin 55 ℃。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用UV暗箱式紫外透射儀觀察電泳結(jié)果并拍照。結(jié)果用Band Leader軟件，以目的條帶/β-actin的灰度值進(jìn)行分析。

2.5Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 用RIPA法取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取20 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白。蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上,3%的BSA液4 ℃封閉過(guò)夜。膜分別用XPD、Bcl-2、Bax、wt-P53和β-actin的Ⅰ抗 (1∶200稀釋) 孵育,4 ℃過(guò)夜, Ⅱ抗孵育2 h,DAB顯色照相。結(jié)果用UVP LabWork 3.0 軟件, 以目的條帶/β-actin的灰度值進(jìn)行分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的鑒定

pEGFP-N2載體在其多克隆位點(diǎn)后帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因。因此，將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD和空載質(zhì)粒pEGFP-N2轉(zhuǎn)染入VSMCs后，在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞則未見(jiàn)綠色熒光，見(jiàn)圖1。這表明質(zhì)粒均轉(zhuǎn)染成功。

Figure 1. The result of fluorescence microscope after plasmid transfection(×100). A:blank control group；B:pEGFP-N2 group；C:pEGFP-N2/XPD group；D:IL-6 group；E:IL-6 + pEGFP-N2 group；F:IL-6+pEGFP-N2/XPD group.

2pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和IL-6對(duì)VSMCs增殖活力的影響

MTT結(jié)果顯示，設(shè)定空白對(duì)照組的存活率為100%，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組的細(xì)胞存活率明顯低于空載質(zhì)粒pEGFP-N2組(Plt;0.05)；IL-6處理組的細(xì)胞存活率明顯高于空白對(duì)照組(Plt;0.05)；IL-6 + pEGFP-N2/XPD組的細(xì)胞存活率明顯低于IL-6 + pEGFP-N2組(Plt;0.05)；而空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間、IL-6處理組與IL-6 + pEGFP-N2組之間相比，差異無(wú)顯著(均Pgt;0.05)。這說(shuō)明pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染能抑制VSMCs的增殖活力，IL-6能促進(jìn)VSMCs增殖，而pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染能抑制IL-6這一作用，見(jiàn)表1。

表1 pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和IL-6處理后VSMCs存活率、細(xì)胞周期及凋亡率的變化

3pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和IL-6對(duì)VSMCs細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組的G0/G1期細(xì)胞明顯增多(Plt;0.05)，S期細(xì)胞明顯減少(Plt;0.05)；與空白對(duì)照組相比，IL-6處理組的G0/G1期細(xì)胞明顯減少(Plt;0.05)，S期細(xì)胞明顯增多(Plt;0.01)；與IL-6 + pEGFP-N2組相比，IL-6 + pEGFP-N2/XPD組的G0/G1期細(xì)胞明顯增多(Plt;0.01)，S期細(xì)胞明顯減少(Plt;0.01)；而空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間、IL-6處理組與IL-6 + pEGFP-N2組之間相比，差異無(wú)顯著(均Pgt;0.05)。這說(shuō)明pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染能使得VSMCs進(jìn)入S期出現(xiàn)障礙，停滯在G0/G1期的細(xì)胞增多，IL-6能使得VSMCs進(jìn)入S期細(xì)胞增多，停滯在G0/G1期的細(xì)胞減少，而pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染能抑制IL-6這一作用，見(jiàn)表1。

4pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和IL-6對(duì)VSMCs凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組的細(xì)胞凋亡率明顯高于空載質(zhì)粒pEGFP-N2組(Plt;0.01)；IL-6處理組的細(xì)胞凋亡率明顯低于空白對(duì)照組(Plt;0.01)；IL-6 + pEGFP-N2/XPD組的細(xì)胞凋亡率明顯高于IL-6 + pEGFP-N2組(Plt;0.01)；而空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間、IL-6處理組與IL-6 + pEGFP-N2組之間相比，差異無(wú)顯著(均Pgt;0.05)。這說(shuō)明pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染能促進(jìn)VSMCs的凋亡，IL-6能減弱VSMCs的凋亡，而pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染能抑制IL-6這一作用，見(jiàn)表1。

5pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和IL-6對(duì)VSMCs的XPD、bcl-2、bax和wt-p53mRNA表達(dá)水平的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染明顯增加了XPD mRNA的表達(dá)(Plt;0.01)；與空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組的bax和wt-p53 mRNA的表達(dá)明顯增多(Plt;0.05)，bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯減少(Plt;0.01)；與空白對(duì)照組相比，IL-6處理組的bax和wt-p53 mRNA的表達(dá)明顯減少(Plt;0.01)，Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯增多(Plt;0.05)；與IL-6 + pEGFP-N2組相比，IL-6 + pEGFP-N2/XPD組的Bax和wt-p53 mRNA的表達(dá)明顯增多(Plt;0.01)，bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯減少(Plt;0.05)；而空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間、IL-6處理組與IL-6 + pEGFP-N2組之間相比，差異無(wú)顯著(均Pgt;0.05)。這說(shuō)明pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染能增加VSMCs的XPD mRNA的表達(dá)，同時(shí)使得Bcl-2 mRNA的表達(dá)降低、bax和wt-p53 mRNA的表達(dá)增高，IL-6能使得bcl-2 mRNA的表達(dá)增高、bax和wt-p53 mRNA的表達(dá)降低，而pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染能抑制IL-6這一作用，見(jiàn)圖2。

6pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和IL-6對(duì)VSMCs的XPD、Bcl-2、Bax和wt-P53蛋白表達(dá)水平的影響

Western blotting結(jié)果顯示，pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染明顯增加了XPD 蛋白的表達(dá)(Plt;0.05)；與空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組的Bax和wt-P53蛋白的表達(dá)明顯增多(Plt;0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯減少(Plt;0.05)；與空白對(duì)照組相比，IL-6處理組的Bax(Plt;0.05)和wt-P53(Plt;0.01)蛋白的表達(dá)明顯減少，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯增多(Plt;0.05)；與IL-6 + pEGFP-N2組相比，IL-6 + pEGFP-N2/XPD組的Bax和wt-P53蛋白的表達(dá)明顯增多(Plt;0.01)，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯減少(Plt;0.05)；而空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間、IL-6處理組與IL-6 + pEGFP-N2組之間相比，差異無(wú)顯著(均Pgt;0.05)。這說(shuō)明pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染能增加VSMCs的XPD蛋白的表達(dá)，同時(shí)使得Bcl-2蛋白的表達(dá)降低、Bax和wt-P53蛋白的表達(dá)增高，IL-6能使得Bcl-2蛋白的表達(dá)增高、Bax和wt-P53蛋白的表達(dá)降低，而pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染能抑制IL-6這一作用，見(jiàn)圖3。

Figure 2. The changes of XPD, bcl-2, bax and wt-P53 mRNA level in VSMCs treated with pEGFP-N2/XPD transfection and IL-6. M: marker.A:blank control group；B:pEGFP-N2 group；C:pEGFP-N2/XPD group；D:IL-6 group；E:IL-6 + pEGFP-N2 group；F:IL-6 + pEGFP-N2/XPD group±s. n=3. *Plt;0.05, ** Plt;0.01 vs B group；#Plt;0.05, ## Plt;0.01 vs A group；▲Plt;0.05, ▲▲ Plt;0.01 vs E group.

Figure 3. The changes of XPD, Bcl-2, Bax and wt-P53 protein levels in VSMCs treated with pEGFP-N2/XPD transfection and IL-6. A:blank control group；B:pEGFP-N2 group；C:pEGFP-N2/XPD group；D:IL-6 group；E:IL-6 + pEGFP-N2 group；F:IL-6 + pEGFP-N2/XPD group. ±s. n=3. *Plt;0.05 vs B group；#Plt;0.05, ## Plt;0.01 vs A group；▲Plt;0.05, ▲▲ Plt;0.01 vs E group.

討 論

TFⅡH是一個(gè)由9個(gè)亞基(XPB、XPD、P62、P52、P44、P34、cdk7、cyclinHT和MATl)組成的多酶復(fù)合物，XPD作為支架，介導(dǎo)著復(fù)合物內(nèi)部的連接[10]。XPD基因的突變與3種人類遺傳性疾病相關(guān)，分別是著色性干皮病，Cockayne綜合征和毛發(fā)硫性營(yíng)養(yǎng)不良[11]。XPD具有單鏈DNA解旋酶活性[12]，參與了核酸剪切修復(fù)，它的功能缺陷可導(dǎo)致突變的基因不能得到有效的修復(fù)，同時(shí)也會(huì)影響一些癌基因和抑癌基因的功能，從而促使腫瘤的發(fā)生[13]。而且，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，XPD能抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[4]。

近年來(lái)的觀點(diǎn)認(rèn)為AS是一種炎癥性疾病[14，15]。其中，VSMCs過(guò)度增殖被認(rèn)為是促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素[7]。而且，在AS損傷中，IL-6[8]、干擾素-γ[16]和低密度脂蛋白[17]等因素能刺激VSMCs過(guò)度增殖。由此可見(jiàn)，與腫瘤的發(fā)生類似，AS亦是由細(xì)胞的異常增殖而引起的。

因此，我們可以假設(shè)：XPD能抑制IL-6介導(dǎo)的VSMCs過(guò)度增殖，并促進(jìn)其凋亡。為此，本研究將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染VSMCs使得XPD高表達(dá)，并給予IL-6刺激VSMCs增殖，然后觀察VSMCs增殖和凋亡的變化。結(jié)果顯示，XPD高表達(dá)能抑制VSMCs增殖并促進(jìn)其凋亡，能增加Bax和wt-P53的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)；IL-6能刺激VSMCs增殖并抑制其凋亡，能降低Bax和wt-P53的表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)；而XPD高表達(dá)能抑制IL-6的這一作用。

在AS的發(fā)病機(jī)制中，IL-6刺激VSMCs過(guò)度增殖[8]。本研究用IL-6刺激VSMCs增殖，這在一定程度上類似于AS的發(fā)生。而XPD高表達(dá)能抑制IL-6促增殖及抑凋亡的作用，這提示我們也許可以通過(guò)上調(diào)VSMCs的XPD表達(dá)來(lái)治療AS。bcl-2基因是抑凋亡基因，bax基因是促凋亡基因，Bcl-2蛋白表達(dá)升高和Bax蛋白表達(dá)降低被認(rèn)為是凋亡被抑制。在本研究中，XPD能抑制IL-6升高VSMCs的Bcl-2表達(dá)和降低Bax表達(dá)的作用，即進(jìn)一步證明XPD能減弱IL-6抑制VSMCs凋亡的作用。P53有野生型和突變型兩種亞型，其中野生型P53(wt-P53)對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。在本研究中，XPD能升高wt-P53的表達(dá)，即XPD促凋亡作用是通過(guò)P53這條途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這與同為TFⅡH亞基的XPB通過(guò)P53凋亡途徑產(chǎn)生促凋亡作用一致[18]。綜上所述，XPD能抑制VSMCs增殖并促進(jìn)其凋亡，并能抑制IL-6促進(jìn)VSMCs增殖和降低其凋亡的作用，有望成為治療AS的靶點(diǎn)。

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EffectsofhumanxerodermapigmentosumgroupDgeneonproliferationofhumanvascularsmoothmusclecellsinducedbyinterleukin-6

DING Hao, LI Ju-xiang, HONG Kui, SUN Guo-fang, ZHANG Nan, WU Yan-qing, WU Qing-hua, CHENG Xiao-shu

(DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,JiangxiProvincialKeyLaboratoryofMolecularMedicine,Nanchang330006,China.E-mail: 24055886@qq.com)

AIM: To investigate the effects of human xeroderma pigmentosum group D (XPD) gene on the proliferation of human vascular smooth muscle cells (VSMCs) induced by interleukin-6 (IL-6).METHODSRecombinant plasmid pEGFP-N2/XPD and vacant plasmid pEGFP-N2 were transfected into VSMCs by liposome, and then these cells were incubated with IL-6 at 1×105U/L for 48 h. The cells were divided into 6 groups: blank control group; pEGFP-N2 group; pEGFP-N2/XPD group; IL-6 group; IL-6 + pEGFP-N2 group; IL-6 + pEGFP-N2/XPD group. The expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope. The cell growth was detected by MTT method. The cell cycle and apoptosis rate were examined by flow cytometre. The expression levels of XPD, Bcl-2, Bax and wild type P53 (wt-P53) were detected by RT-PCR and Western blotting.RESULTSGreen fluorescence was observed in the cells transfected with pEGFP-N2/XPD or pEGFP-N2, indicating successful transfection MTT results showed that the transfection of pEGFP-N2/XPD inhibited the cell growth, and reduced the positive effects of IL-6 on VSMCs growth. Flow cytometry results showed that the transfection of pEGFP-N2/XPD increased the apoptosis rate of VSMCs and the cell numbers in G0/G1phase, decreased the cell numbers in S phase, and reduced the effects that IL-6 decreased the apoptosis rate of VSMCs and the cell numbers in G0/G1phase, and increased the cell numbers in S phase. The results of RT-PCR and Western blotting showed that the transfection of pEGFP-N2/XPD increased the expression of XPD, Bax and wt-P53, decreased the expression of Bcl-2, and reduced the effects that IL-6 decreased the expression of Bax and wt-P53, and increased the expression of Bcl-2.CONCLUSIONXPD gene inhibits VSMCs proliferation, promotes VSMCs apoptosis, and reduces the effects that IL-6 promotes VSMCs proliferation and inhibits VSMCs apoptosis. Therefore, XPD gene is likely to be potential molecular target for treatment of atherosclerosis.

Xeroderm pigmentosum group D gene; Interleukin-6; Vascular smooth muscle cells; Cell proliferation; Apoptosis

1000-4718(2011)04-0625-07

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.001

2010-11-08

2011-02-25

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(“973”計(jì)劃)資助項(xiàng)目(No.2008CB517305)

△通訊作者 Tel：0791-8060095；E-mail:24055886@qq.com