理中湯、人參皂苷Rg1、6-姜酚對Caco-2細胞PepT1轉(zhuǎn)運功能影響的比較

郭文峰，胡 燦，劉 佳，高小玲，陳蔚文

（廣州中醫(yī)藥大學 脾胃研究所，廣東 廣州 510405）

PepT1（Peptide Transporter 1）是蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物小分子肽（二肽、三肽）在小腸吸收的主要轉(zhuǎn)運體，其表達和功能直接影響蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物的吸收水平，我們認為PepT1的功能與“脾主運化水谷精微”是密切相關(guān)的。前期動物實驗研究中觀察到脾陽虛模型大鼠小腸黏膜PepT1轉(zhuǎn)運功能增強，蛋白表達上調(diào)，理中湯治療可逆向調(diào)節(jié)這種改變［1-2］。本次實驗擬從培養(yǎng)Caco-2細胞模型，觀察理中湯、人參皂苷Rg1、6-姜酚對體外培養(yǎng)細胞PepT1表達及功能影響，并三者作用的異同。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

14C-Glycyl-Sarcosine，購自 American Radiolabeled Chemicals Inc.，批號：090731，濃度0.1mCi／mL；8-Bromoadenosine-3′，5′-cyclic mono-phosphorothioate，Rp-isomer（簡稱Rp-8-Br-cAMP），Simga公司產(chǎn)品，批號：029K1157；Glycyl-Sarcosine，Sigma公司產(chǎn)品，批號 142871122009161；PEPT1抗體：ABCAM公司產(chǎn)品；定量PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix購自TOYOBO公司；Transwell聚碳酸酯膜單細胞層培養(yǎng)板，嵌入膜直徑24mm，孔徑0.4μm，Corning公司產(chǎn)品，批號： 20109011；定量PCR儀：美國Stratagene公司實時熒光定量PCR儀Mx3005P；Millicell?-ERS跨膜電阻測定儀，美國Millipore公司產(chǎn)品；液體閃爍及發(fā)光儀：Perkin Elmer 1450，美國Perkin Elmer公司產(chǎn)品；電泳儀：PowerPac Universal，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；紫外可見光分光光度計：Beckman Coulter DU?520，德國貝克曼公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)：KADAK Image Station 2000MM，美國Eastman Kodak公司產(chǎn)品；理中湯：黨參、干姜、白術(shù)、炙甘草購自廣州市藥材公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定為桔梗科植物黨參Codonosips pilosula（Franch.）Nannf.的根、姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的根莖、菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的根莖、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖；以上4藥以1∶1∶1∶1的比例水煎煮2次合并煎液，中性濾紙過濾后，冷凍干燥備用。細胞培養(yǎng)試驗需要加藥時，稱取理中湯冷凍干燥粉末，用PBS溶解后，孔徑0.22μm的微孔濾器過濾后加入到細胞培養(yǎng)液中。人參皂苷Rg1，購自購自甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司，純度＞98%，批號 20091027；6-姜酚（6-Gingerol，C17H26O4，CAS.23513-14-6），購自甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司，純度＞98%，批號20091106。

1.2 細胞株

Caco-2細胞，來源于人結(jié)腸腺癌細胞，結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細胞。購自American Type Culture Collection（ATCC，HTB-37），Lot.No.57850025。

1.3 Caco-2細胞培養(yǎng)，單細胞層模型建立及給藥

取代次為25～28的Caco-2細胞。為了測定Caco-2細胞從頂膜向基底膜的14C-Glycyl-Sarcosine吸收轉(zhuǎn)運，將Caco-2細胞種植于跨膜轉(zhuǎn)運6孔培養(yǎng)板微孔濾膜上，初始種植密度為2.0×105／孔，每孔上、下室各加入高糖DMEM培養(yǎng)基2.0mL，隔日更換培養(yǎng)基，參照文獻［4］報道方法，待細胞長成致密單細胞層后，再連續(xù)培養(yǎng)28d后進行試驗。

用跨膜電阻測定方法［4］確定致密單細胞層模型的建立。將跨膜電阻測定儀的兩個電極分別插入跨膜轉(zhuǎn)運6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)小室的上下室培養(yǎng)液中，讀取跨膜電阻值。加入DMEM培養(yǎng)基后，未種植細胞的跨膜轉(zhuǎn)運6空培養(yǎng)板上下室之間的跨膜電阻小于120Ω，聚碳酸酯膜上細胞形成致密細胞層后，其跨膜電阻當大于200Ω。

1.4 14C-Glycyl-Sarcosine轉(zhuǎn)運觀測

更換跨膜轉(zhuǎn)運6孔培養(yǎng)板上下小室中的培養(yǎng)基，在上室2.0mLDMEM培養(yǎng)基中分別加入理中湯（用PBS配制成100mg·mL-1的母液）、人參皂苷Rg1（用PBS配制成濃度為5.0mmol／L的母液）、6-姜酚（用 DMSO配制成1.0mM 的母液），使其終濃度分別為1.0mg·mL-1，50μmol·L-1，50μmol·L-1，同時設(shè)理中湯加Rp-8-Br-cAMP組，人參皂苷Rg1加Rp-8-Br-cAMP組，6-姜酚加Rp-8-Br-cAMP組，在加入等量理中湯／人參皂苷Rg1／6-姜酚的同時，加入Rp-8-Br-cAMP（用DMSO溶解，配制成濃度為5.0mmol·L-1的母液），使Rp-8-Br-cAMP的終濃度為50.0μmol·L-1，另設(shè)正常對照組，DMEM培養(yǎng)基中加入等體積的DMSO，每組設(shè)3個復孔。更換培養(yǎng)基及添加受試藥的同時，每孔在上室培養(yǎng)基中加入Glycyl-Sarcosine-［Gly-1-14C］及未標記的 Glycyl-Sarcosine，使Glycyl-Sarcosine終濃度為50μmol·L-1。

置于37℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于5、10、15、30、60、120min時取下室培養(yǎng)基100μL，液體閃爍計數(shù)儀測定14C-Glycyl-Sarcosine濃度，計算Caco-2單細胞層對Glycyl-Sarcosine的轉(zhuǎn)運功能，用于評價PepT1對二肽的轉(zhuǎn)運能力。

1.5 膜蛋白中PepT1蛋白表達檢測

采用westernblot方法進行。Caco-2細胞種植于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)條件和給藥方案同“1.4”項下，在給藥24h后，移去培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，根據(jù)細胞量加入相應的膜蛋白提取緩沖液，4℃輕搖15min，收集裂解液到EP管中，14000r·min-1離心15min，取上清液到新的EP管中。BCA（Bicinchoninc acid assay）法測量蛋白濃度后，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，80V恒壓50min，120V恒壓電泳至溴酚藍剛出膠底部止。低溫條件下，100V恒壓60～120min轉(zhuǎn)移電泳至聚偏氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF）膜，取出雜交膜，TBST（Tris Buffered Saline with Tween 20）緩沖液漂洗5min，3次。5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1h或4℃過夜。TBST緩沖液洗膜5min，3次。一抗稀釋液4℃過夜或37℃孵育2h。TBST洗膜5min，3次。二抗稀釋液37℃孵育1h。TBST洗膜5min，3次。蒸餾水漂洗膜2min，棄去液體，共洗3次。將化學熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面，并使反應持續(xù)5min。用試劑盒提供的濾紙吸去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒曝光，顯影。凝膠成像系統(tǒng)測定條帶灰度值，以PepT1表達灰度值（IODPepT1）與同組內(nèi)參GAPDH 灰度值（IODGAPDH）的比值（Ratio＝IODPepT1／IODGAPDH）為各組蛋白表達相對值，用于組間比較。

1.6 熒光定量PCR檢測SLC15A1（PepT1mRNA）表達

細胞培養(yǎng)和給藥方法同“1.4”項下，受試藥作用24h后。收集細胞，提取總RNA。采用紫外分光光度計測定D260／D280方法進行RNA純度檢測，確認RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。瓊脂糖凝膠電泳法進行總RNA完整性檢測。

逆轉(zhuǎn)錄：在RNase free的PCR管中，取1.0μg總RNA，稀釋至12μL。吹打均勻，置65℃保溫5min，使RNA變性。隨后立即冰上致冷，以防止RNA復性；在該PCR管中加入Oligo（dT）0.5μL、Random primer 0.5μL、10mM 三磷酸脫氧核糖核苷（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）2.0μL、RNase inhibitor 0.5μL、5×RT buffer4.0μL、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μL。將上述20μL反應溶液30℃保溫10min，42℃保溫60min，72℃保溫10min。定量PCR：檢測序列片段大小。內(nèi)參片段：18SrRNA-112bp；目的片段：AQP1-151bp。設(shè)計的引物：表達PepT1蛋白的mRNA為SLC15A1，qh-SLC15A1-F1：5’CTGCCCTGAAGTGAAGGTGT，qh-SLC15A1-R1：5’GATCTCCGCTGGGTTGATGT。反應體系總體積20.0μL：cDNA（1：15）5.0μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10.0μL、dH2O4.0μL。反應條件：預變性95℃5min，95℃15s，65℃15s，72℃20s讀板，40cycles。融解曲線分析：溫度60℃～95℃，每分鐘讀1次。

以SLC15A1熒光值（qSLC15A1）與內(nèi)參18s熒光值（q18s）的比值，即SLC15A1相對值＝qSLC15A1／q18s，用以判斷SLC15A1表達水平的高低。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 單細胞層模型建立

Caco-2細胞融合后，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)28天，跨膜電阻測定結(jié)果表明致密單細胞層模型已經(jīng)形成，空白對照孔電阻為110Ω，試驗孔跨膜電阻測定結(jié)果均大于230Ω。表明單細胞層結(jié)構(gòu)致密，可用于模擬腸上皮細胞吸收轉(zhuǎn)運試驗。

2.2 各組14C-Glycyl-Sarcosine轉(zhuǎn)運測定結(jié)果

液體閃爍計數(shù)儀測定14C-Glycyl-Sarcosine量，通過已知濃度樣品測定結(jié)果制作標準曲線，計算對應Glycyl-Sarcosine濃度。各組別細胞Glycyl-Sarcosine吸收轉(zhuǎn)運量及其與不同時間點之間的關(guān)系如表1所示。

表1 各組Caco-2細胞轉(zhuǎn)運Glycyl-Sarcosine量的比較（n＝3，）

表1 各組Caco-2細胞轉(zhuǎn)運Glycyl-Sarcosine量的比較（n＝3，）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與理中湯組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01；與人參皂苷組 Rg1組比較，5）P＜0.05，6）P＜0.01；與6-姜酚組比較，7）P＜0.05，8）P＜0.01。

4±0.54 Rp-8-Br-cAMP組 1.48±0.70 1.98±0.72 2.81±0.56 4.42±0.631） 4.71±0.831）理中湯 1.63±0.31 4.52±0.571） 6.34±0.572） 7.29±0.641） 8.23±0.671）理中湯+Rp-8-Br-cAMP 1.74±0.42 2.68±0.463） 4.13±0.464） 6.45±0.68 6.73±0.432）3）人參皂苷Rg1組 1.81±0.14 3.86±0.341） 5.18±0.542） 8.08±0.752） 8.56±0.422）Rg1+Rp-8-Br-cAMP組 2.11±0.48 2.95±0.325） 3.39±0.655） 4.70±0.706） 4.90±0.362）6）6-姜酚組 1.58±0.42 2.61±0.61 4.49±0.63 6.84±0.461） 8.61±0.542）6-姜酚+Rp-8-Br-cAMP組 1.61±0.45 2.13±0.52 3.76±0.55 6.02±0.59 6.92±0.677）5min 15min 30min 60min 120min正常對照組 1.53±0.14 2.42±0.68 3.15±0.76 5.62±0.20 6.5組別 Glycyl-Sarcosine吸收轉(zhuǎn)運累計量（μmol／孔）

從表1結(jié)果可知，理中湯、人參皂苷Rg1及6-姜酚均在不同程度上表現(xiàn)為促進Caco-2細胞轉(zhuǎn)運Glycyl-Sarcosine的作用，與未經(jīng)藥物處理的正常對照組Caco-2細胞比較，其累計轉(zhuǎn)運Glycyl-Sarcosine的總量明顯增加（P＜0.05），理中湯及人參皂苷Rg1起效較快，在給藥15min后即明顯高于對照組，6-姜酚增加Caco-2細胞轉(zhuǎn)運Glycyl-Sarcosine的作用表現(xiàn)較為緩慢，于60min后明顯高于正常對照組。

cAMP的抑制劑Rp-8-Br-cAMP對Caco-2細胞轉(zhuǎn)運Glycyl-Sarcosine有抑制作用，且能抑制理中湯及人參皂苷Rg1促進Caco-2細胞二肽轉(zhuǎn)運的作用，理中湯合用Rp-8-Br-cAMP后，Caco-2細胞轉(zhuǎn)運Glycyl-Sarcosine累計總量于15min至120min時分別明顯低于單用理中湯處理組。Rp-8-Br-cAMP對6-姜酚的作用不如其對理中湯及人參皂苷Rg1的作用明顯。

2.3 各組PepT1蛋白表達westernblot試驗結(jié)果

圖1 PepT1蛋白表達結(jié)果

結(jié)果表明，Caco-2細胞經(jīng)理中湯／人參皂苷Rg1／6-姜酚處理24h后，細胞膜PepT1蛋白表達水平均明顯增高，而Rp-8-Br-cAMP顯著降低膜PepT1蛋白表達水平，Rp-8-BrcAMP與6-姜酚合用，可抑制6-姜酚增加Caco-2細胞膜PepT1表達的作用，其PepT1蛋白表達水平接近空白對照組，低于單用6-姜酚組（P＜0.05）。Rp-8-Br-cAMP與理中湯及人參皂苷Rg1合用對理中湯及人參皂苷Rg1增減Caco-2細胞膜PepT1蛋白表達的作用未見明顯影響。見表2。

表2 理中湯對Caco-2細胞膜PepT1蛋白表達的影響（）

表2 理中湯對Caco-2細胞膜PepT1蛋白表達的影響（）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與理中湯組比較，3）P＜0.05；與6-姜酚組比較，7）P＜0.05。

組別 n Ratio值正常對照組3 0.220±0.019 Rp-8-Br-cAMP組 3 0.073±0.0182）理中湯 3 0.326±0.0312）理中湯+Rp-8-Br-cAMP 3 0.248±0.0273）人參皂苷Rg1 3 0.308±0.0281）Rg1+Rp-8-Br-cAMP 3 0.323±0.0192）6-姜酚組 3 0.317±0.0222）6-姜酚+Rp-8-Br-cAMP組 3 0.249±0.0217）

2.4 各組SLC15A1表達熒光定量PCR檢測結(jié)果

表3結(jié)果表明，Rp-8-Br-cAMP處理24h后SLC15A1表達明顯下調(diào)（P＜0.01）。6-姜酚能明顯上調(diào)Caco-2細胞SLC15A1表達，但合并應用Rp-8-Br-cAMP后，6-姜酚上調(diào)SLC15A1表達的作用被明顯抑制。人參皂苷對Caco-2細胞SLC15A1表達的作用表現(xiàn)為下調(diào)，理中湯對Caco-2細胞SLC15A1表達作用不明顯。

表3 理中湯對Caco-2細胞SLC15A1表達的影響（）

表3 理中湯對Caco-2細胞SLC15A1表達的影響（）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與6-姜酚組比較，7）P＜0.05。

組別 復孔數(shù) SLC15A13 2.83±0.18 Rp-8-Br-cAMP組 3 1.94±0.102）理中湯 3 2.61±0.26理中湯+Rp-8-Br-cAMP 3 2.72±0.24人參皂苷Rg1 3 2.31±0.231）Rg1+Rp-8-Br-cAMP 3 2.57±0.356-姜酚組 3 3.71±0.232）6-姜酚+Rp-8-Br-cAMP組 3 2.94±0.217）相對值正常對照組

3 討論

脾陽虛動物模型小腸黏膜上皮PepT1表達及其轉(zhuǎn)運二肽的能力有明顯改變，溫陽健脾方理中湯對這種改變具有治療作用［1-2］。體外培養(yǎng)Caco-2細胞試驗研究結(jié)果顯示［5］，理中湯具有促進正常培養(yǎng)Caco-2細胞轉(zhuǎn)運二肽化合物Glycyl-Sarcosine的作用，該作用可能與其促進胞漿中PepT1蛋白嵌入胞膜中發(fā)揮轉(zhuǎn)運二肽的功能有關(guān)，該過程調(diào)控與胞內(nèi)第二信使cAMP有一定的關(guān)系。

本研究結(jié)果中，理中湯全方、人參皂苷Rg1、6-姜酚均可促進Caco-2細胞轉(zhuǎn)運二肽化合物Glycyl-Sarcosine，且與cAMP的抑制劑Rp-8-Br-cAMP合用時表現(xiàn)為明顯的抑制，表明二肽化合物經(jīng)由細胞膜中肽轉(zhuǎn)運載體PepT1的轉(zhuǎn)運與胞內(nèi)信使cAMP的參與有關(guān)。

蛋白表達實驗結(jié)果中，理中湯全方、人參皂苷Rg1、6-姜酚均能增加Caco-2細胞膜PepT1蛋白表達，合并運用胞內(nèi)cAMP抑制劑Rp-8-Br-cAMP后，理中湯及6-姜酚上調(diào)Caco-2細胞PepT1蛋白表達的效應受到抑制（P＜0.05），而Rp-8-Br-cAMP對人參皂苷Rg1的促Caco-2細胞PepT1蛋白表達并無明顯作用。分析其原因，可能與三者作用的具體機制分別相關(guān)，具體機制有待進一步研究觀察予以揭示。

表達肽轉(zhuǎn)運載體蛋白PepT1的基因為SLC15A1，我們采用熒光定量PCR方法檢測了經(jīng)過Caco-2細胞SLC15A1基因的表達情況，結(jié)果表明，6-姜酚對SLC15A1也有明顯上調(diào)作用，與蛋白表達結(jié)果及細胞轉(zhuǎn)運二肽化合物Glycyl-Sarcosine的測定結(jié)果基本一致。而人參皂苷Rg1對SLC15A1基因表達的作用反而表現(xiàn)為下調(diào)，其結(jié)果與二肽轉(zhuǎn)運結(jié)果不一致，推測可能由于人參皂苷Rg1可促進胞漿中已有的PepT1蛋白嵌入頂膜發(fā)揮二肽轉(zhuǎn)運作用有關(guān)，且本次研究受試藥作用時間較短，其下調(diào)基因表達的效應尚未影響到PepT1蛋白的總量及轉(zhuǎn)運能力。

方劑配伍規(guī)律的研究一直是中醫(yī)藥科研的熱點，諸多學者從藥理學、藥物化學等各個領(lǐng)域開展了大量的研究工作，也取得了長足的進展，為闡明中醫(yī)復方的配伍規(guī)律奠定了一定的工作基礎(chǔ)。本次研究，通過比較人參皂苷Rg1、6-姜酚及理中湯全方對Caco-2細胞PepT1蛋白轉(zhuǎn)運能力、蛋白及mRNA表達的作用，發(fā)現(xiàn)三者作用各有分別，可為理中湯的配伍規(guī)律提供實驗依據(jù)。

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