非小細胞肺癌中DPC4基因的表達與bcl-2及VEGF之間的關系

何 玲 ，尚麗娜 ，楊 磊 ，李曉琴 ，李 敏

（1.蘭州大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

非小細胞肺癌中DPC4基因的表達與bcl-2及VEGF之間的關系

何 玲1，2，尚麗娜2，楊 磊2，李曉琴3，李 敏1

（1.蘭州大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

目的研究DPC4（Deleted in Pancreatic Carcinoma Locus 4，DPC4）基因在非小細胞肺癌中的表達及其與凋亡抑制蛋白bcl-2及血管內皮細胞生長因子（VEGF）的關系。方法利用免疫組織化學SP法檢測65例非小細胞肺癌組織和18例癌旁正常肺組織中DPC4、bcl-2和VEGF的表達。結果DPC4在非小細胞肺癌中的陽性率為50.8%（33/65），在癌旁正常肺組織中的陽性率為77.8%（14/18），2者之間的比較有顯著性差異（P<0.05）；DPC4與性別、年齡及病理類型無關（P>0.05），但與非小細胞肺癌的分期、分級和淋巴結轉移顯著相關（P<0.05）；65例非小細胞肺癌中，DPC4的表達與bcl-2、VEGF均呈負相關。結論DPC4基因的缺失可能與非小細胞肺癌的惡性進展如分期、分級及淋巴結轉移有關，DPC4基因的缺失可能抑制非小細胞肺癌細胞凋亡并上調VEGF表達來促進血管的生成。

DPC4；非小細胞肺癌；免疫組織化學；VEGF；bcl-2

DPC4(Deleted in Pancreatic Carcinoma Locus 4)是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤抑制基因，在胰腺、膽道、結腸等胃腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其蛋白產物Smad4介導對TGF-β家族的應答，在TGF-β受體信號傳遞途徑中具有重要的作用。但DPC4在肺癌中的表達與凋亡抑制蛋白bcl-2及VEGF之間的關系到目前為止還不甚清楚。本研究應用免疫組化SP法檢測了65例肺癌組織和18例相應的癌旁正常肺組織DPC4基因的蛋白表達，以探討其在肺癌發(fā)病機制中的作用及其與凋亡抑制蛋白bcl-2及VEGF之間的關系，為今后以DPC4基因為靶點對肺癌進行基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

65例肺癌標本及18例癌旁正常組織均為甘肅省腫瘤醫(yī)院2008年5月～2010年3月經病理證實的手術切除組織。65例肺癌患者中，男50例，女15例，年齡32～81歲，平均年齡為60歲。其中鱗癌38例，腺癌27例；高分化癌17例，中分化癌34例，低分化癌14例；有淋巴結或遠處轉移者31例，無轉移者34例。18例癌旁正常組織為對照組。所有標本均經10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，并進行HE染色。

1.2 試劑和方法

鼠抗人DPC4、bcl-2和VEGF單克隆抗體購自Maxim-Bio公司，均為即用型。免疫組織化學SP試劑盒為北京中杉金橋產品。實驗步驟嚴格按試劑盒說明進行，PBS代替一抗作陰性對照，以已知陽性片作陽性對照，用DAB顯色，蘇木精復染。

1.3 免疫組織化學結果判斷

DPC4、bcl-2和VEGF免疫組織化學結果以細胞質內出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。顯微鏡下觀察DPC4、bcl-2和VEGF蛋白的分布、陽性強度和陽性率。先按染色強度打分:0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，染色強度需與背景著色相對比；再按陽性細胞所占百分比打分:0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%，染色強度與陽性細胞百分比的乘積≥2分為免疫反應陽性（+）。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，DPC4的表達與不同臨床病理參數(shù)的關系采用χ2檢驗，DPC4和bcl-2、VEGF的關系采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 DPC4、bcl-2和VEGF在肺癌組織及癌旁正常組織中的表達

DPC4陽性表達主要定位在癌旁正常組織的氣管上皮細胞及腫瘤細胞的胞質上（見圖1、圖2）。癌旁正常組織及癌組織的陽性率分別為77.8%（14/18）和50.8%（33/65），癌旁正常組織中DPC4的表達明顯高于癌組織（P<0.05）。bcl-2和VEGF的陽性表達主要定位在細胞胞質（見圖3、圖4）。肺癌組織中VEGF、bcl-2陽性表達率分別為80.2%（53/65）和53.8%（35/65），癌旁正常組織中VEGF、bcl-2 陽性表達率分別為 44.4%（8/18） 和 11.1%（2/18），肺癌中VEGF、bcl-2的陽性表達顯著高于癌旁正常組織（P<0.05）。

圖1 DPC4在癌旁正常肺組織中呈高表達（SP×100）

圖2 DPC4在中分化肺鱗癌組織中呈低表達（SP×200）

圖3 bcl-2在高分化肺腺癌中呈陽性表達（SP×200）

圖4 VEGF在高分化肺腺癌中呈陽性表達（SP×40）

2.2 肺癌中DPC4的表達與臨床病理特征的關系（見表1）

表1 DPC4的表達與肺癌臨床病理特征之間的關系

由表1可知，65例肺癌組織中Ⅰ-Ⅱ期的肺癌組織中DPC4的陽性率顯著高于Ⅲ-Ⅳ期肺癌組織（P<0.05），而且隨著分化程度的降低，DPC4的陽性率逐漸降低，2者之間的比較有極著性差異（P<0.01）。65例肺癌中有淋巴結轉移的肺癌組DPC4陽性率顯著低于無淋巴結轉移組（P<0.05）。肺癌中DPC4表達在患者的性別、年齡、病理類型間比較，無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 肺癌中DPC4表達與bcl-2及VEGF表達之間的關系（見表2）

表2 肺癌中DPC4表達與bcl-2及VEGF表達之間的關系

對65例肺癌組織中DPC4、bcl-2及VEGF表達的結果進行重新賦值，陰性（-）為1、陽性（+）為 2，將DPC4分別與 bcl-2和VEGF進行Spearman相關分析。結果顯示，DPC4與bcl-2（P<0.05）及 VEGF（P<0.05）均呈負相關關系。

3 討論

大量研究表明，DPC4基因的缺失在胰腺癌、結直腸癌以及肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用[1～2]。本研究顯示，65例非小細胞肺癌中DPC4的表達率為50.8%，與正常肺組織中的表達相比顯著降低（77.8%），提示DPC4的低表達與非小細胞肺癌發(fā)生有關，此結果與Bai等[3]的研究結果相同。Gregory等[4]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中Smad4蛋白的表達與腫瘤的分級以及分期有關，分化越差的前列腺癌，其DPC4(Smad4)缺失率越高。Maitra等[5]通過免疫組織化學染色發(fā)法對不同分期的結直腸癌組織標記DPC4后，發(fā)現(xiàn)DPC4的功能缺失可能是在結直腸癌惡性進展的后期發(fā)生的，本研究顯示DPC4與非小細胞肺癌組織的分級、分期明顯相關，分化越差分期越高的肺癌組織，其DPC4的表達越低。同時，有淋巴結轉移的肺癌組中DPC4陽性率顯著低于無淋巴結轉移的肺癌組,這些結果提示DPC4的失活可能發(fā)生在腫瘤進展的后期，屬于晚期分子事件，并且可能參與了腫瘤浸潤和轉移的過程。這一結果與Barbera等[6]的報道相同。

DPC4是TGF-β家族的直接酶底物，它具有抑制細胞生長，抑制腫瘤轉移等多種功能[7]。Kolek等[8]發(fā)現(xiàn)在HC11鼠乳腺上皮細胞中TGF-β1能夠通過線粒體途徑使bax活化和易位，從而誘導細胞的凋亡。同時研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β在閉鎖卵泡細胞[9]、人晶狀體上皮細胞[10]、多能造血細胞[11]、人卵巢癌細胞[12]、結直腸癌細胞[13]中介導凋亡時會出現(xiàn)bcl-2水平的降低。bcl-2作為凋亡抑制蛋白對調節(jié)細胞凋亡具有關鍵性作用。但是DPC4與bcl-2之間到底是什么關系，到目前為止還不清楚。本研究結果顯示，bcl-2與DPC4之間呈負相關關系，提示DPC4可能在TGF-β1介導的細胞凋亡過程中具有重要的作用，這與Ke等[14]的結論一致。TGFβ1在細胞凋亡的啟動過程中具有重要的作用，而DPC4作為TGF-β2信號通路中的重要傳導分子,其低表達會影響TGF2β促凋亡信號的傳導,從而使凋亡細胞數(shù)降低。王春雷等[15]也證實DPC4能夠促進細胞的凋亡。

血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是一種高度特異的內皮細胞有絲分裂原，能夠促進內皮細胞增殖，增加微血管通透性以及誘導血管生成，而且它在病理性血管生成過程中也具有中心調控作用，是腫瘤細胞分泌的血管形成因子中最重要的一種，也是目前已知的功能最多、作用最強的促血管生成因子之一[16]。它與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移和預后密切相關。有報道表明，TGF-β1具有活化血管生長因子的作用，其信號轉導通路在微血管塑形中具有重要的作用[17]。Schwarte-Waldhoff等[18]在研究胰腺癌時發(fā)現(xiàn)，在體內DPC4的重新表達抑制了腫瘤的形成,但是TGF-β卻沒有這樣的作用。同時，DPC4還可以通過減少VEGF的表達，增加血管形成抑制因子血小板反應蛋白21(TSP21)的表達來抑制血管的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，DPC4與VEGF呈負相關關系，DPC4陽性的肺癌組織中VEGF陽性率明顯低于DPC4陰性的肺癌組織，提示DPC4基因的缺失可能參與VEGF促進血管生成的機制。

綜上所述，DPC4的失活可能與非小細胞肺癌的惡性進展如分期、分級及淋巴結轉移有關，DPC4基因的缺失可能抑制肺癌細胞凋亡并促進其表達VEGF，從而使得肺癌逐漸向惡性進展并最終轉移。

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1671-1246（2011）04-0078-03