Toll樣受體4與器官移植排異

趙 毅，蔡 真 綜述

(浙江大學醫學院附屬第一醫院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

隨著現代醫學的發展，器官移植越來越多地成為了治療惡性疾病的手段，為患者獲得新生提供了機會。可是，隨著器官移植手術的廣泛開展，移植后主要并發癥之一，移植排異極大影響了移植效果，增加了患者死亡率，阻礙了移植醫學的發展。由于器官移植是人為引入外來器官，因此不可避免帶來異己抗原的識別問題。其中，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是微生物入侵后預警免疫系統必需的天然免疫受體，可對病原相關的分子模式(pathogenassociated molecular pattern，PAMP)進行識別，其與炎癥和自身免疫性疾病的發生密切相關，在天然免疫防御中起重要作用，此外，新近的研究表明，TLRs還參與同種異型器官移植過程中的排斥反應。本文對TLR4在器官移植排異發生過程中所起的具體作用做一綜述。

1 TLR4在內毒素誘導的信號轉導中起主導作用

TLR家族到目前為止共發現有13類受體，其中對由 Medzhitov等人在1997年發現的TLR4分子的研究最為深入和全面。TLR4廣泛表達在各種細胞表面，其既包括非特異性免疫細胞，如巨噬細胞、樹突細胞、中性粒細胞和肥大細胞，又包括介導特異性免疫反應的T淋巴細胞和B淋巴細胞。此外，TLR4在人皮膚角質細胞、氣道上皮細胞、胚腎細胞和某些小腸上皮細胞等非淋巴細胞表面也可檢測到。

隨著對TLR4的分子結構、識別受體、內毒素(LPS)誘導的信號傳導途徑及基因缺陷型動物模型等研究的深入，TLR4在機體免疫系統中的重要性也日益顯現。TLR4作為識別細菌共有成分的形態識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，在LPS誘導的信號轉導中起主導作用，TLR4是識別LPS的主要受體，還能被一些內源性配體如熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)、纖維連接蛋白 A結構域(fibronectin A domain)等活化。在 TLR4 的基因上，即使僅出現一個堿基的突變，也會導致宿主對革蘭陰性菌的反應能力嚴重喪失。TLR4基因缺失患者對LPS呈免疫耐受狀態。LPS作為革蘭氏陰性菌外膜成分，先與血清中脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)結合后再與CD14形成復合物，此復合物中的 LPS解聚后與 TLR4結合，導致TLR4的聚合而活化，在MD-2的輔助下，活化的TLR4通過其胞漿區Toll/IL-1受體同源區(Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR)，與胞漿內接頭蛋白MyD88(myeloid differentiation protein，髓樣分化蛋白)的C-端TIR結合形成復合物，再通過MyD88的N-端死亡結構域(death domain，DD)結合 IL-1受體相關激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)，二者作用導致IRAK的自身磷酸化，從而激活腫瘤壞死因子受體相關因子-6(TNF-αreceptor associated factor 6，TRAF-6)，活化的IRAK與TRAF6結合后，可使TAK1(即TGF-β活化的激酶)活化，從而通過IκB激酶級聯反應，最后導致轉錄因子AP-1(activating protein-1)家族的成員Jun和fos活化。而NF-кB和AP-1的活化均可導致炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6和NO等的大量表達，介導炎癥反應。其信號轉導可以介導B7家族成員表達活化，進而通過抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APC)使 T細胞增殖及分化。這條途徑即MyD88依賴信號傳導途徑。此外，LPS/TLR4信號的傳導還可以通過另外一條通路MyD88非依賴信號傳導途徑(TRIF依賴途徑):TRIF(TIR domaincontainingadaptor molecule-1，TICAM-1)全稱為TLR樣受體相關的干擾素活化子，也稱含有TIR的接頭分子。TRIF相關的接頭分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)在TLR4的信號傳遞途徑中起到輔助TRIF傳導信號的作用。激活核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)從而激活 IкB激酶(IKK)。干擾素調節因子 3(interferon regulation factor 3，IRF3)是轉錄因子，是TRIF依賴途徑的最終效應分子，可引起細胞內的終活化子NF-κB分子的激活，引發機體一系列的反應。在此信號通路中，如果TLR發生變異，則信號傳導受阻，機體不能產生免疫應答。

2 T細胞的活化決定器官移植排斥的發生

遺傳基因不同的個體之間的器官移植，由于供、受體移植抗原的不同，既可引起宿主的排斥反應，又可引起供體來源的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)。在這個過程中，異種T細胞活化是移植反應中的關鍵環節，它的活化需要2個信號，第一信號是抗原遞呈細胞向T淋巴細胞遞呈處理過的抗原肽復合物，第二信號是來自APC的CD80、CD86和CD40等共刺激分子的共刺激信號。近來研究認為，在T細胞反應的早期，當T細胞識別APCs遞呈的抗原時，APCs是否能夠表達足夠的CD86、CD80和CD40等共刺激分子決定了T細胞是否產生免疫應答，或是未被活化導致凋亡或無能。T淋巴細胞只有在第一、第二信號共同刺激下才能被激活和發生增殖，從而啟動由淋巴細胞、細胞因子和補體等多因素參與的移植免疫排斥反應。

目前，移植免疫的研究主要集中在T細胞和B細胞等特異性免疫領域，雖然取得了顯著的成就，但仍未能完全解決移植中的一些關鍵問題。根據文獻報道和我們的臨床經驗，在HLA位點相合的造血干細胞移植中，II-IV急性GVHD發病率高達30%以上，而且隨HLA不合程度增加，GVHD發病率及嚴重程度明顯增高。即使早期應用霉酚酸酯(mycophenolatemofetil，MMF)、環 孢 素 A(eyclosporine A，CsA)等多種免疫抑制劑，仍有很多移植術后的患者發生難以控制的GVHD。Rachel等對 23 個以上的臨床研究進行總結，發現器官移植后受者體內新生的抗HLA抗體與急性和慢性排斥的增加有關聯，其可降低腎臟、心臟、肺、肝和角膜移植后移植物的存活率。而HLAⅠ和Ⅱ型抗體似乎均為損害移植物的抗體，大多數研究均提示供體的特異性抗體與移植物排斥有關。檢測移植后體內HLA抗體可以預測患者異基因排斥的發生情況，幫助鑒別移植物的無能是免疫性還是非免疫性因素所致。

異基因造血干細胞移植后宿主發生GVHD，主要是移植物中的成熟T細胞被宿主的異型組織相容性抗原(包括主要與次要相容性抗原)所激活，增殖分化為效應T細胞。這些激活的效應細胞對宿主的組織和器官發動免疫攻擊，從而導致GVHD的發生。所以，為了降低宿主GVHD的嚴重程度，移植前需要對供受者的主要組織相容性抗原進行配型，從而增加移植的成功率。此外，尋找影響移植后GVHD發生的其他因素也成為了關注的重點。

3 TLR4在器官移植排斥中的重要作用

人TLR4基因有Asp299Gly和Thy399Ile兩個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點，其與TLR介導的免疫反應減弱有關。在TLR4突變體移植受者中，接受肺移植后發生急性排斥反應的概率小，發病率為44%，而正常TLR4基因表型的移植受者發病率為 71%。在腎移植中，TLR4 突變體受者的急性移植排斥發病率為7.4%，野生型受者發病率為26.1%，明顯高于前者。此外，有學者證實發生Asp299Gly變異的個體，易受到革蘭氏陰性細胞感染的威脅。也有研究者發現，TLR4突變的腎移植受者，其發生急性排斥的風險要比TLR4正常人群小，而且不易發展為動脈粥樣硬化。在對心臟移植術后患者進行研究后顯示，TLR4表達水平高的受者心臟發生慢性排斥反應的風險要明顯小于TLR4低表達患者，這說明TLR4參與了心臟移植過程的調控。在MHC不匹配的小鼠間進行同種異型心臟移植研究發現，除了TLR3以外，所有TLRs信號途徑都以MyD88作為共同的信號連接蛋白。MyD88缺陷小鼠盡管活化T細胞的功能受損，而發生慢性移植排斥反應的受者其單核細胞TLR4的表達上調，IL-12和TNF-α的分泌增加，依然可以引發移植排斥反應，說明抗原特異性的免疫反應仍然是決定排斥或耐受的關鍵，也說明免疫調節是一個很復雜的過程。

TLR4參與移植排斥的可能機制是:抗原遞呈細胞表面的 TLR4與配體結合后，通過MyD88依賴性或非依賴信號途徑激活NF-κB，誘導機體釋放相關免疫因子，促進了樹突狀細胞、單核細胞等APC成熟，并上調MHC-Ⅱ及CD80、CD86等共刺激分子的表達，提供了T細胞活化必須的第二信號，APC移行至淋巴結，并通過抗原組織相容性復合物(MHC)的遞呈作用刺激特異性T細胞，激活初始型T細胞，使其增殖分化為效應細胞，產生炎癥細胞因子，引發一系列反應，最后對宿主組織或移植物產生破壞。進一步研究發現，TLR激活的APCs分泌能誘導TH1分化的重要細胞因子IL-12，促進CD4+T細胞向TH1或TH2型細胞分化，不同的異種抗原通過結合不同的TLRs，引發不同的免疫反應，而效應性T細胞向不同的方向分化決定了免疫反應的差異。如低劑量LPS易誘發Th2免疫反應，而高劑量LPS則誘發Th1免疫反應。大多數的學者認為，TLR信號主要引起Th1免疫反應。TH1型細胞主要分泌細胞因子IFN-γ、IL-2等，并主要參與細胞免疫，增加移植物的排斥;TH2型細胞主要分泌細胞因子IL-4、IL-10。一般認為T細胞Thl亞群向Th2亞群漂移，可以改變移植物局部的免疫反應，抑制細胞介導的排斥反應。由此可見，TLRs在誘導獲得性免疫和對移植物排斥反應的過程中起著重要橋梁作用。

Goldstein等在小鼠皮膚移植模型實驗中發現，TLR依賴的信號傳導途徑能夠誘導DC細胞成熟，誘導CD8+T細胞的活化，從而激發異基因免疫反應。這表明天然免疫系統在異基因移植抗原識別中也起著重要作用。由此可見，TLRs不僅在機體固有免疫應答中發揮重要作用，同時也是連接固有免疫與適應性免疫的橋梁。

為了防治GVHD和移植排斥，臨床使用多種免疫抑制劑，大多主要作用于T淋巴細胞，取得了較好的療效，但同時也提高了感染和移植后腫瘤復發的風險。雖然供受者之間的HLA位點不相合是GVHD的重要危險因素，但是細菌感染也是GVHD的主要病因之一。革蘭氏陰性菌及其內毒素成分LPS，在小鼠骨髓移植模型中已經被發現與GVHD發生有關。接受LPS耐受供者骨髓的小鼠GVHD嚴重情況明顯低于接受LPS敏感供者的小鼠。當細菌通過腸黏膜后，在供者T細胞分泌的炎性因子的作用下，LPS激活巨噬細胞分泌TNF-α等效應分子。而且在小鼠移植模型中，內毒素血癥和巨噬細胞活化與GVHD的發病機制密切相關。Elmaagacli等發現，在造血干細胞移植中，TLR4基因的突變與嚴重GVHD的發病率相關。TLR4基因的突變可以調控造血干細胞移植患者的免疫反應能力。Lorenz等通過對237名造血干細胞移植患者的TLR基因多態性分析后認為，TLR4基因的突變可以減少急性GVHD的發生，但是這種突變增加了革蘭氏陰性菌感染的幾率。以上眾多研究表明，TLR4在非特異性免疫中可廣泛識別配體，既可針對入侵的病原體，也可識別改變的自身成分，充分顯示了TLR4在識別危險信號并誘發機體免疫反應中的重要性。

Nomura等還發現，TLR4 表達的變化會影響機體對內毒素的耐受性。用不同劑量LPS二次重復刺激小鼠腹腔巨噬細胞，發現炎癥因子的分泌與LPS的劑量和LPS處理后的時間呈依賴性減少;再者，TLR4的表達在1 h內開始呈持續性梯度下降，并保持24 h，而炎癥因子的分泌與TLR4下調呈正相關，這可能是內毒素耐受程度與TLR4的下調程度呈正相關的機制。Manicassamy等發現，MyD88 是介導TLR4信號轉導通路中的重要環節，而MyD88功能缺失則導致TLR信號的表達缺陷。MyD88缺陷引起移植物排斥減弱的機制是DC成熟受阻，從而導致T細胞增殖的障礙及Th1免疫反應減弱，但同時檢測IL-4、同種IgG1時卻發現并未影響到Th2免疫反應。由上可見，TLR4依賴的內毒素信號傳導通路中的某些環節發生改變將不同程度的產生對LPS的耐受性。這一特點將對我們在控制急性GVHD中細胞因子“瀑布樣效應”起到一定的啟示作用。

4 展望

TLR4信號傳導途徑與機體器官移植后的免疫排斥反應有密不可分的聯系。研究TLR4信號途徑如何通過調控APC成熟、活化T細胞、引發免疫攻擊等具體機制以及探討TLR4對誘導移植免疫耐受的重要影響等，將幫助我們在以后的臨床治療中針對個體制定策略，預防和治療同種器官移植后患者免疫排斥反應。同時也可能為將來針對TLR4相關免疫抑制靶點研發出高效免疫抑制藥物，為減輕移植排斥提供新的治療手段。

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