低氧細胞應激的HIF-1信號通路

王蘋蘋，孔繁平，陳學群，杜繼曾 綜述

(浙江大學醫學院基礎醫學系，浙江 杭州 310058)

氧是機體進行新陳代謝的必需物質，缺氧對機體和細胞是一種強烈的應激。細胞通過氧感受器和信號轉導通路特異地調節某些基因或蛋白的表達來適應低氧［1］。HIF-1α是哺乳動物維持氧平衡最主要的調節因子。近10年來，低氧研究主要集中在HIF-1α介導的基因轉錄調控方面。低氧可以增加HIF-1的穩定性，促進HIF-1與低氧反應元件(hypoxia response element，HRE)的結合，從而誘導低氧靶基因的激活。此外，HIF通路和其它信號通路間也存在交叉調節，形成了細胞低氧應答的特異性和多樣性。

1 低氧誘導因子HIF-1

1.1 HIF-1的基本結構 HIF-1是由分子量為120 kD的 HIF-1α和分子量為91－94 kD的HIF-1β或稱芳香烴受體核轉位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)2種亞基組成的異源二聚體［2］，2亞基均屬于basic helix-loop-helix(bHLH)/PER-ARNT-SIM(PAS)家族蛋白［3］，N 末端均含有 bHLH/PAS同源區。bHLH區和N末端PAS中間區對于二聚化以及與靶基因的結合必不可少。HIF-1α亞基的中部有一個氧依賴降解結構域(oxygen dependent degradation domain，ODDD);C 端是反式激活區，包括2個反式激活域(transactivation domain，TAD)即 TAD-N(amino acids 531-575)和TAD-C(amino acids 786-826);2個TAD序列間的區域為抑制結構域(inhibitory domain，ID;amino acids 576-785)，抑制TAD的轉錄激活［4］。

HIF-α 亞基包括 HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α，這3種HIF-α的亞型都由氧來調節其蛋白的穩定性，在低氧條件下可以與HIF-1β結合調節靶基因的轉錄。HIF-1α和HIF-2α在結構上有48%的氨基酸序列是相同的，能識別同樣的DNA結合區，但各自又有獨特的生物學效應。有研究表明，HIF-2α參與長期慢性的低氧反應，而 HIF-1α 則與急性低氧反應有關［5］。HIF-3α不誘導激活 HIF的靶基因，大鼠HIF-3α有1個僅包含bHLH和PAS區的IPAS蛋白(inhibitory PAS domain protein)，IPAS對HIF調節的基因表達可能起負反饋抑制作用，IPAS可以和HIF-1α結合形成沒有功能的二聚體，這個二聚體在細胞核內不能與靶基因的低氧反應元件結合，形成了一種細胞特異或環境特異的應對低氧的策略［6］。

1.2 HIF-1α蛋白的功能調節 HIF-1α位于細胞質中，在常氧下極易降解，半衰期不足5 min;但在低氧下HIF-1α穩定性和轉錄活性都顯著增加，其主要有2條氧依賴的途徑調節HIF-1α蛋白穩定性和轉錄活性:①FIH-1(factor-inhibiting HIF-1)是一種氧依賴性酶，可將HIF-1α C末端反式激活結構域內803位的天冬氨酸殘基羥基化，阻止HIF-1α與轉錄輔助激活因子CBP(CREB-binding protein)/p300結合，從而抑制 HIF-1α 的轉錄激活功能［7］。②脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，PHDs)也是氧依賴性酶，可以使HIF-1α的564位(HIF-2α的531位)和402位的脯氨酸殘基被羥基化，然后腫瘤抑制蛋白(von hippel-lindau protein，pVHL)與 HIF-1α亞基的 ODDD結合，募集多種泛素蛋白，共同組成泛素連接蛋白酶復合體，使HIF-1α亞基泛素化，并經泛素連接蛋白酶復合體途徑降解［8］。不同組織中PHDs的表達不同，與不同HIF蛋白的親和力也不盡相同，這可能導致了低氧應答的多樣性。在低氧下，PHDs和FIH-1的活性被抑制，HIF-1α不被降解，導致胞內蛋白水平迅速增加。在HIF-1α蛋白C末端有核定位信號(NLS)，輔助HIF-1α蛋白快速和核孔蛋白結合入核。HIF-1β在缺氧及正常細胞的胞漿和核中均存在，其與HIF-1α的N末端激活域結合，形成二聚體后與CBP/p300結合開始轉錄。

HIF-1α在轉錄后可被 SUMO(small ubiquitin-like modifier)修飾，這是一個被SUMO特異性連接酶催化和被SUMO特異性蛋白酶(SENPs)逆轉的動態過程。這些生理過程現在并未研究清楚，有些報道也有矛盾之處。HIF-1α活性的增加和抑制都有報道，而且低氧可以增加 HIF-1α 的 SUMO 修飾［9］，而 SUMO 修飾能通過脯氨酸殘基的羥基化來增強HIF-1α和VHL的結合，導致HIF-1α的泛素化降解。相反，SENPs參與的HIF-1α去SUMO修飾可以避免其在低氧下被降解［9］。HIF-1β同樣能被SUMO修飾，調節與其它蛋白的關系［10］。但是，這種SUMO修飾對HIF-1β和HIF-α蛋白的相互作用機制目前尚不清楚。

最近，研究者發現了很多可以調節HIF-1α活性的蛋白質和小分子物質。HIF-1α可以被NO介導的亞硝基化修飾，從而增強常氧條件下的蛋白穩定性和活性［11］。熱休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)可以氧依賴的結合在HIF-1α的PAS區，阻止HIF-1α的泛素化降解。RACK1(receptor for activated protein C kinase 1)與Hsp90競爭結合在HIF-1α的PAS結構域，從而增加 HIF-1α的降解。17-AAG(17-allylaminogeldanamycin)是 Hsp90的抑制物，它可以阻斷Hsp90與HIF-1α的結合，促進RACK1的結合，激活HIF-1α泛素化降解［12］。

2 低氧反應元件HRE

HRE是一個復雜的調節元件，由保守的HIF-1結合位點(HIF-1 binding site，HBS)A/GCGTG和高度可變的旁側序列組成［13］。HIF-1α亞基穩定后向核內轉移，與β亞基二聚化形成HIF-1結合在低氧反應元件HRE上。與HIF通路調控相比，目前對HRE序列的特征了解還很少，只知道在低氧轉錄激活作用中HRE是最小的一個順式調節元件［14］。100多個研究表明，在有功能的HBS序列中特定核苷酸有特定的位置，也就是說HBS的核心序列呈現非隨機性，不一定就是 N(－3)N(－2)A/G(－1)C(1)G(2)T(3)G(4)。A在－1位置的概率是4.5倍，而T出現在 －3位置的概率是4.2倍［13］。有一些研究報道了HRE序列與它調控功能之間的關系，比如突變分析－2位置發現低氧誘導作用按 T＞G＞C的順序下降。回文序列CACGTG之所以低氧誘導作用低可能是該序列競爭結合了一些抑制因子，如HIF-1β的同源二聚體。內皮素1(endothelin-1，ET-1)的 HRE AACGTG的低反應性也認為HBS序列－2位置的核苷酸有重要關系［16］。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因轉錄起始點上游大約1 kb的5'側翼區域有286 bp的HRE。HRE區域內存在HBS 5'ATCGTGGG3'和HIF-1結合的輔助序列(HIF-1 ancillary sequence，HAS)5'CACAG3'［16］。兩者是低氧 VEGF 轉錄激活的順式作用元件，調控VEGF在低氧條件下的轉錄。EPO基因的3'端上存在一個低氧反應元件，HIF-1識別5'-TACGTGCT-3'，特異性地結合在這個反應元件上，調節EPO基因在低氧下的轉錄水平［3］。最近的研究發現，人類肝癌細胞(HepG2)轉染含有類胰島素樣生長因子結合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP-1)調控區，分別暴露于20% 和1% 氧濃度24 h，結果發現HIF-1結合在斑馬魚胚胎的IGFBP-1基因調控區的HBS上。－1086/－1090處的 HBS 3'-ACGTG-5'和 －1099/－1103處HAS 3'-CAGGT-5'對于低氧誘導IGFBP-1的表達都是重要的［17］。HAS位于HRE上游8 bp處，在HIF-1誘導斑馬魚IGFBP-1的激活中是必不可少的。HAS并不是直接與HIF-1作用的，也不影響它鄰近HRE與HIF-1的結合。常氧條件存在一種核蛋白與HAS相結合，而這種物質以及它的作用目前尚不清楚。但是，在鐵轉運蛋白中HRE是由2個鄰近的HBSs形成，在各種糖分解的酶以及葡萄糖轉運體中HRE是由鄰近2或3個HBSs組成的［18］。

一個HBS是必要的，但是不足以激活低氧反應，高度可變的旁側序列結合其它不一定與低氧有關的轉錄因子，使HRE調節達到頂峰，這對于增強低氧反應或形成HRE的細胞特異性有重要作用［8］。在乳酸脫氫酶 A(lactate dehydrogenase A，LDHA)基因的HRE中有轉錄激活因子1和cAMP反應元件結合蛋白-1(ATF-1/CREB-1)的結合位點［19］。GATA 結合轉錄因子2(GATA-binding transcription factor-2，GATA-2)和AP-1元件對于ET-1的高表達是必要的［20］。VEGF基因HRE中發現AP-1的結合位點，在EPO基因HRE中有肝細胞核因子4(hepatic nuclear factor 4，HNF-4)的結合位點［21］。HRE的多樣性可能增強了低氧反應性和不同組織的反應特異性，豐富了靶基因的多樣性［18］。

3 HIF-1在不同疾病中的作用

HIF-1通過激活靶基因的轉錄，在低氧相關的生理狀態和病理過程中發揮作用，目前已知有70多種基因受HIF-1調節［22］。

3.1 HIF-1在缺血誘導的血管生成中的作用 HIF-1的活性對于組織缺血后的恢復是十分必要的。HIF-1可以上調與血管系統相關蛋白的基因表達，如促進血管生成的VEGF及其受體;使血管收縮的物質，如誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、ET-1 和血紅素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)等來增加血流，降低缺血損傷。在HIF-1α基因敲除的股動脈結扎模型中，發現VEGF等血管生長因子沒有被激活，缺血后再灌注能力降低［23］。在其它的損傷模型中也發現，HIF-1α的促血管生成作用，包括心肌肥大、心肌梗塞、傷口愈合和視網膜血管再生等模型［24-26］，而 HIF-2α在這些模型中的促血管生成作用并不明顯［27］。這些結果表明，HIFα尤其是HIF-1α在缺血組織中介導促血管生成的作用。此外，在胚胎發育中，HIF-1對胚胎血管系統的建立和發育也至關重要［28］。

3.2 HIF-1在缺血后細胞代謝中的作用 在動脈粥樣硬化疾病中，心臟、腦和肌肉這些組織都可能處于缺血狀態，HIF-1的激活對它們適應缺血起關鍵作用。HIF-1參與重建細胞代謝途徑來實現對心臟和腦組織的保護。因為氧作為線粒體呼吸電子傳遞鏈的受體，低氧適應的關鍵是將代謝途徑轉到非氧化的碳代謝和ATP產生途徑，如糖酵解。HIF能啟動葡萄糖轉運體和LDHA來介導這個通路的轉換。HIF-1的另一個靶基因丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase-1，PDK1)編碼的 PDK蛋白可以抑制乙酰輔酶A的合成，阻斷三羧酸循環，降低氧消耗［29］。HIF-1缺失的細胞在低氧后ATP產量降低，產生更多的氧自由基，促使其凋亡［29］。最近的研究顯示，HIF-1的激活還能影響磷酸戊糖途徑［30］，這條途徑能將糖酵解的中間產物轉化為合成核苷酸的重要原料5-磷酸核糖。這些研究結果表明，HIF-1依賴的代謝通路的轉換，能促進細胞在低氧下存活，而且HIF-1將葡萄糖代謝轉換成RNA和DNA合成所需的一個步驟，這對于低氧腫瘤細胞的存活和生長可能有重要意義。

3.3 HIF-1在癌癥發生中的作用 腫瘤細胞的快速增殖導致血液供應不足使腫瘤細胞經常處于低氧環境，所以腫瘤組織中HIF通常高表達［32］。此外還有一些非低氧依賴激活HIF的途徑，比如在腎癌細胞中VHL的突變，在結腸癌中Wnt通路的突變導致 HIF穩定性的提高［32］。研究顯示，HIF調節的不同靶基因在多種腫瘤的發生發展過程都有關鍵作用，包括增殖(Myc家族、IGF家族)、血管生長(VEGF、EPO)、凋亡/自噬(BNIP3、NIX)、代謝(PDK1、LDHA)、DNA損傷(GADD45A)、胞內基質重構(MMP1、LOX)、細胞遷移和逃逸(CXCR4)［32］。然而，不同的HIFα亞基在腫瘤發生中有不同的功能，在VHL敲除的細胞研究中顯示，可能是HIF-2α而不是HIF-1α對于腫瘤發生是必需的［32］，一種可能的解釋是 HIF-1α 抑制了 Myc的功能［33］。另外，低氧HIF-1α能與p53結合，誘導p53的穩定和細胞凋亡［34］。相反，HIF-2α間接抑制p53的活性而提高腫瘤細胞對輻射和化學物質的抵抗［35］。目前以HIF為靶點的研究給癌癥治療提供了新的策略。

3.4 HIF-1在細胞自噬中的作用 低氧(氧濃度＜3%)和缺氧(氧濃度＜0.1%)都能誘導細胞的自噬甚至是凋亡，然而這兩種情形有不同的分子機制。低氧引起的自噬是HIF依賴的途徑，而缺氧引起的自噬則是非HIF依賴的途徑［36-37］。在低氧下(氧濃度1% ～3%)，HIF 激活BNIP3和NIX(BNIP3L)的轉錄，進而抑制Beclin1和Bcl-2的功能［38］，導致細胞凋亡。另外，位于線粒體外膜的NIX表達WXXL基序，其被LC3識別并結合，導致線粒體產生自噬。BNIP3的轉錄還可以被轉錄因子FOXO3激活，而FOXO3和HIF共同被Sirt1所調節［39］。

3.5 HIF-1在炎癥反應中的作用 發生炎癥的時候，局部血管通透性增強，導致更多的免疫細胞到達炎癥部位。因為血流減慢，炎癥細胞和抗原耗氧量增加導致炎癥部位形成局部低氧環境。在關節炎、動脈硬化和自身免疫性疾病患者的相應炎癥部位都發現了低氧環境和HIF的激活［40］。免疫細胞對低氧的應答和 NF-κB信號通路密切相關。在巨噬細胞、中性粒細胞和一些非免疫細胞中發現，HIF可以激活NF-κB［40］。低氧可以抑制 PHD1的活性，導致IKK的激活，進而磷酸化IκB，解離出的NF-κB導致下游基因的轉錄激活，如炎癥因子［41］。在巨噬細胞中NF-κB直接調節HIF-1α的轉錄。缺乏IKK的巨噬細胞即使在低氧下也不能形成穩定的HIF-1α蛋白，但是，只有NF-κB的激活同樣不能使HIF-1α穩定，這些結果顯示，HIF-1α的激活需要NF-κB和低氧的共同調節。而HIF-2α 在低氧下的激活則不需要 IKK［42］。缺乏HIF-1的巨噬細胞表現出遷移能力降低，吞噬細菌能力減弱，炎性細胞因子的分泌降低。

3.6 HIF-1在機體系統性低氧中的作用 除了上述病理狀態下的低氧或缺氧，HIFα在機體的生理低氧狀態中也發揮重要作用，如進入高原或者劇烈運動后，造血器官通過增加紅細胞數目來增加血液的攜氧能力，而這個過程是由HIFα的靶基因EPO所介導的［43-44］。人和小鼠上的研究表明，成年個體EPO水平和造血能力受PHD-2/VHL/HIF-2α通路調節。家族性紅細胞增多癥是一種血紅蛋白和紅細胞異常增多的遺傳病，研究表明，這種疾病是由于VHL發生突變使HIF-1α不能在常氧下降解，從而激活EPO導致的［44］。最近，關于世居高原的藏族人和漢族人的基因組研究發現了PHD-2/VHL/HIF-2α 通路的進化［45-47］，等位基因 SNP的顯著差異發生在PHD-2和HIF-2α基因上，或者是靠近這些基因的位置。由此推測，藏族人的PHD-2和HIF-2α受到青藏高原物理環境的選擇壓力而產生了突變，賦予藏人適應青藏高原的能力。最直接的表現就是藏族人對慢性高原病有強的抵抗力，而慢性高原病的發生與低氧靶基因EPO介導的造血能力提高有關。青藏高原動物和實驗動物小鼠的比較研究發現，低氧激活小鼠肝臟HIF-1α高表達，但沒有激活高原屬兔和根田鼠肝臟HIF-1α表達，而低氧靶基因IGF-1、IGFBP-1和LDH轉錄展示出“多模式化”調節方式［48］，高原動物青海湖裸鯉HIF-1α進化速率分析發現，低溫因素對HIF-1α進化的影響大于低氧因素對其影響，其靶基因Glut1的轉錄受低氧調節，表現出組織特異性差異，在低氧下腦和肝臟Glut1 mRNA表達明顯比肌肉和心臟低［49］。

圖1 低氧信號通路和Notch、Myc信號通路的交叉調節Fig.1 Hypoxia signaling pathways crosstalk with Notch and Myc pathways

4 HIF信號通路和其它信號通路的相互調節

信號通路的相互調節是當前研究的熱點，也是細胞對不同的外部信號應答的重要方式。研究表明，Myc和Notch信號通路對低氧反應通路有調節作用(圖1)。Myc轉錄因子家族在細胞生長、分化、凋亡和代謝中有關鍵作用。Myc基因的過度表達促進腫瘤細胞的轉化和增殖［50］。Myc和細胞低氧反應的相互調節通路至少有3條。首先，低氧激活HIF-1α后通過下調Myc靶基因抑制 Myc，導致細胞周期停滯［51］。第二，HIF-1α參與低氧抑制的細胞周期及DNA修復相關的基因表達，通過在Myc激活的啟動子區競爭MYC的結合位點，從而抑制MYC的反式激活［52］。第三，低氧依賴的MXI1激活可能負性調節MYC［53］。MXI1是一個潛在的腫瘤抑制因子，通過與轉錄抑制蛋白及MYC的伴侶分子MAX相互作用來抑制MYC，從而抑制MYC-MAX異二聚體復合物表達。HIF-1α和HIF-2α都可以誘導MXI1抑制MYC的活性。HIF-2α還可以與MAX作用，激活MYC基因的轉錄活性，從而促進細胞的生長［33］。

低氧的細胞反應和Notch通路的相互調節同樣復雜，并且存在于多個層次。首先，低氧通過上調Notch配體DLL1和DLL4轉錄水平，增強Notch信號［54］。其次，HIF-1α 和 Notch胞內結構域(Notch ICD)之間可以發生直接作用。HIF-1α被募集到Notch ICD的轉錄復合物上，結合Notch相應的啟動子來激活Notch靶基因［52］。HIF-1α和 Notch ICD的相互作用可能是低氧穩定Notch ICD的基礎。第三，FIH-1不僅使HIF-1α羥基化也使Notch ICD羥基化［55］。FIH-1抑制 Notch信號，相比于 HIF-1α，FIH-1更容易與Notch ICD結合，因此影響了FIH-1介導的 HIF-1α 轉錄活性的抑制［56］。

綜上所述，低氧可以出現在很多生理和病理過程中，HIF-1在細胞、組織和器官的低氧損傷和適應過程中有關鍵的調控作用。目前很多研究針對HIF-1蛋白穩定性的調節，關于HIF-α蛋白質翻譯后修飾如何影響DNA結合、轉錄以及與其它相關蛋白間的相互作用，以及低氧信號轉錄的精確過程尚待進一步研究。

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