博士1:4對蚯蚓的毒性效應研究

李 冰，白桂芬，張 帥

（赤峰學院 生命科學系，內蒙古 赤峰 024000）

博士1:4對蚯蚓的毒性效應研究

李 冰，白桂芬，張 帥

（赤峰學院 生命科學系，內蒙古 赤峰 024000）

采用濾紙接觸法和自然土壤法對內蒙古赤峰市周邊地區(qū)蚯蚓進行染毒，研究了赤峰市周邊地區(qū)普遍使用的博士1：4對蚯蚓的毒性效應.單一試驗的結果表明：兩種方法均能引起蚯蚓中毒或死亡，濾紙法48h時博士1：4半致死濃度(LC50)為2.8732g/L.自然土壤法14d時蚯蚓有明顯中毒現(xiàn)象，但無死亡情況.

蚯蚓；博士1：4；單一污染；濾紙接觸法；自然土壤法

土壤是人類賴以生存的基礎，土壤質量狀況與人類的健康和發(fā)展息息相關.隨著工業(yè)和石油農業(yè)迅猛發(fā)展，工業(yè)廢棄物、化肥和農藥等污染物質的大量排放和施用，給土壤環(huán)境造成相當嚴重的影響，也給人類健康帶來潛在風險.因此，對土壤質量的評價和污染物質毒性的測定是必要的.蚯蚓生態(tài)毒理試驗正是在這樣的需要下發(fā)展起來的[1].蚯蚓作為土壤無脊椎動物的代表，在保持和改善土壤結構、提高土壤肥力、改善土壤透氣性、吸收并降解土壤中的有機物等方面有著重要作用[2].蚯蚓是常見的雜食性環(huán)節(jié)動物，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中具有極其重要的地位，常被作為土壤污染的指示動物，廣泛用于土壤生態(tài)毒性研究[4].因此蚯蚓在農田中具有不可或缺的重要作用.隨著工農業(yè)的發(fā)展，人類為了滿足日益增長的各種需求，追求農田利益的最大化，在農業(yè)中普遍使用化肥、農藥的現(xiàn)象明顯增加.但化肥、農藥顯著增加了農業(yè)利益的同時，也給土壤環(huán)境帶來了巨大的負面影響，致使農藥污染的現(xiàn)象也日趨嚴重.本試驗以蚯蚓為實驗材料以內蒙古赤峰地區(qū)普遍使用的農藥博士1:4為代表，對生物農藥的安全可靠性進行檢測，為赤峰市周邊地區(qū)農藥污染的生態(tài)學檢測、農業(yè)害蟲的生物學防治提供理論依據，同時也為科學地評價這種農藥的生態(tài)安全性積累基礎數據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試動物：蚯蚓在赤峰市周邊地區(qū)蔬菜大棚中采集，試驗選擇體重為400～500mg，環(huán)帶明顯，大小基本一致的健康成蚓.供試土壤：采用蚯蚓原生地土壤，主要采集表層土（0～20cm），采回后經篩細待用.供試污染物：博士1:4，主要成分為二嗪磷，是廣譜性有機磷殺蟲劑，具有觸殺、胃毒和一定的內吸作用.其作用機理為抑制酰膽堿酯酶，二嗪磷，英文通用名稱：Diazinon，分子式：C12H21N2O3PS，化學名稱:O，O-二乙基-O-（2-異丙基-6-甲基-4-嘧啶基）硫逐磷酸酯，結構式：

本實驗采用的農藥博士1:4是由河南農業(yè)大學與中國農業(yè)大學聯(lián)合研制，由河南農業(yè)大學生物化工實驗廠生產，生產日期為2009年10月1日，生產批件：HNP41025-A6814，執(zhí)行標準：Q/HNSH03-2006，登記證號：SY20067618，保質期為兩年.試驗器材：玻璃培養(yǎng)皿（直徑15cm，高2.5cm），濾紙（直徑 15cm，中速），塑料小桶（上直徑15cm,下直徑10cm高8cm，容量1000mL），燒杯等.污染物試驗濃度設計：正式試驗前進行濃度范圍選擇試驗,確定污染物對蚯蚓染毒歷時48h時（濾紙法）和14d（自然土壤法）的最小致死濃度和最大致死濃度，在此區(qū)間內設置各污染物水溶液的正式單一毒性試驗濃度序列.最后確定濾紙法的試驗濃度為：1.5;2.0;2.5;3.0;3.5;4.0g/L；自然土壤法的試驗濃度：30;40;50;60;70;80g/L.

1.2 試驗方法

1.2.1 濾紙接觸法

將挑選的蚯蚓洗凈表面泥土后放入1L的已濕潤的燒杯中，置于暗處清腸一晝夜（以除去腸道內的雜物等）[7].在玻璃培養(yǎng)皿中鋪濾紙（中速）3張，以剛好遮住皿底為宜.將10mL博士1:4水溶液按試驗設計濃度注入墊有3張濾紙的培養(yǎng)皿中，使濾紙全部浸濕.每一濃度設置3個重復，并設置1個不含藥物的空白對照，再將清腸后的蚯蚓沖洗干凈，用濾紙吸去多余水分[8].每處理放入10條蚯蚓，用保鮮薄膜封口，并用解剖針扎孔保持透氣.定期觀察并記錄毒理癥狀和行為；并于24h、48h各觀察1次死亡數，以前尾部對機械刺激無反應視為死亡[8].將試驗數據輸入計算機，應用簡明統(tǒng)計10.35（Concise Statistics,CS10.35)進行統(tǒng)計學處理.

1.2.2 自然土壤法

將蚯蚓洗凈后放入1L燒杯中，噴灑少量水，清腸24h.將500ml蚯蚓原生地土壤倒入解剖盤中，按實驗設計濃度分別量取10mL博士1:4水溶液放入土壤中混勻后倒入塑料小桶.再將清腸后的蚯蚓沖洗干凈，用濾紙吸去多余水分[8].每處理放入10條蚯蚓，如此每濃度分別設計3個重復.放置陰暗處，并于每天7時、18時各噴水一次以保持土壤濕度.觀察并記錄蚯蚓中毒癥狀；并于7d、14d各計數1次，以前尾部對機械刺激無反應視為死亡[8].將試驗數據輸入計算機，應用簡明統(tǒng)計10.35（Concise Statistics,CS10.35)進行統(tǒng)計學處理.

2 結果

2.1 濾紙接觸法測定博士1:4對蚯蚓的單一毒性

博士1:4單一污染蚯蚓表現(xiàn)出的中毒癥狀如下：在濾紙實驗開始時，蚯蚓皮膚與農藥直接接觸，所以蚯蚓有強烈的反應，非常活躍.3h到4h觀察時，則活動減弱.7h到8h觀察時，蚯蚓身體蜷縮，抱團聚在一起并伴有輕微中毒現(xiàn)象，身體微腫，體色略變暗.10h到12h觀察時蚯蚓中毒現(xiàn)象明顯，體色變暗為深紫色，身體縮短、蜷縮，體節(jié)特別明顯，身體及生殖環(huán)腫大.行動明顯減弱.18h到20h觀察時蚯蚓已經出現(xiàn)個別死亡情況，中毒現(xiàn)象嚴重，身體虛弱行動很少.由表1可見，博士1:4的濃度為1.5g/L至4.0g/L時，污染暴露24h對蚯蚓不產生致死效應.當污染暴露48h對蚯蚓表現(xiàn)明顯的致死效應.且蚯蚓死亡率隨污染濃度的增大而升高（見表1，圖1）.對表1的試驗數據進行統(tǒng)計分析，以博士1:4的濃度為橫坐標，蚯蚓的死亡率為縱坐標，得到回歸方程如下：

D=27.049X1--27.719(R2=0.98983595,n=6,P<0.005)①

表1 博士1：4濾紙接觸法蚯蚓死亡情況

圖1 博士1：4濾紙接觸法不同濃度和時間條件下蚯蚓的死亡率

其中，D為蚯蚓死亡率（%），X1為博士1:4濃度（g/L），P為顯著性水平，R為相關系數，n為試驗處理數.根據上述方程可計算出博士:4的LC50為2.8732g/L.

2.2 自然土壤法測定博士1:4對蚯蚓的單一毒性

試驗3d后檢查時，蚯蚓有明顯的中毒現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為身體腫大并伴有僵硬現(xiàn)象，身體縮短，體色發(fā)暗為深紫色，環(huán)節(jié)突出，活動減少.7d時中毒現(xiàn)象與三天時一樣，但現(xiàn)象更加明顯，無死亡現(xiàn)象.但在第12d時，蚯蚓中毒現(xiàn)象略為緩解，分析可能為農藥在土壤中藥效降解的原因所致.14d檢測時發(fā)現(xiàn)蚯蚓中毒癥狀有明顯的降低趨勢，身體縮短狀況與僵硬現(xiàn)象明顯好轉，無死亡現(xiàn)象.將實驗時間延長一周后，蚯蚓中毒情況明顯減弱，未出現(xiàn)死亡情況.但由于蚯蚓在塑料盆里養(yǎng)殖時間過長，體質變弱.由于14d時蚯蚓無死亡現(xiàn)象，所以無實驗數據.（表 2，圖 2）.

表2 博士1：4自然土壤法法蚯蚓死亡情況

圖2 博士1：4自然土壤法不同濃度和時間條件下蚯蚓的死亡率

3 討論與分析

博士1:4的主要成分二嗪磷為中毒性，具有觸殺、胃毒和一定的內吸作用.主要適用范圍是對鱗翅目、同翅目等多種害蟲均有較好的防治效果，防治多種作物的地下害蟲.二嗪磷是廣譜性有機磷殺蟲劑，其作用機理為抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）.AChE在蚯蚓的神經傳遞過程中起著重要作用.AChE的活性主要用于評價有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥對蚯蚓的毒性效應.這兩類農藥均可抑制蚯蚓AChE活性，從而使蚯蚓神經傳遞受阻[9].

3.1 濾紙接觸法測定博士1:4對蚯蚓的單一毒性

濾紙接觸法是直接將蚯蚓暴露在一定濃度的農藥環(huán)境下的試驗方法，簡單易行，可以初步了解化學藥品的固有毒性和對土壤動物的潛在毒性[10].從博士1:4對蚯蚓的單一毒性試驗結果看，在濾紙試驗中24h和48h時，博士1:4單一毒性試驗組的蚯蚓的LC50為2.8732g/L，博士1:4對蚯蚓的毒害隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，隨著農藥濃度的增加而增加，說明博士1:4對蚯蚓是有毒害作用的，而蚯蚓也對博士1:4有一定的耐受能力.如果農藥濃度過高，超出了蚯蚓的耐受能力，則會危害蚯蚓的生長和生存.

3.2 自然土壤法測定博士1:4對蚯蚓的單一毒性

在自然土壤法的預實驗中，連續(xù)多次提升農藥濃度但蚯蚓在14d內并沒有死亡情況，分析原因一方面可能是市面上的農藥博士1:4雖然是08年以后出產，但生產所用原料全是08年所產，由于這些原料放置時間過長而導致藥效降低.另一方面，自然土壤法的特點是簡便易行，可用于具體地區(qū)污染物的環(huán)境安全性評價，但各地區(qū)試驗結果可比性差[11].不同地區(qū)、環(huán)境中的土壤對藥物的降解情況有所不同.而藥物通過接觸對蚯蚓產生的毒性不僅取決于藥物的固有毒性，還與藥物在土壤中的狀態(tài)及在蚯蚓體內的藥物代謝動力學密切相關[10].而且博士1:4是藥肥一體的農藥，毒性成分二嗪磷含量較低，所以蚯蚓在較高的實驗濃度下未發(fā)生死亡情況.

從實驗結果來看，在自然土壤法中蚯蚓雖然沒有死亡情況，但有明顯的中毒現(xiàn)象，所以在農藥濃度的選取上還有待研討.本實驗研究將繼續(xù)進行.

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A

1673-260X（2011）03-0140-03

內蒙古自治區(qū)教育廳高等學校研究項目(NJ10249);赤峰學院重點扶持學科項目資助