一氧化氮在有氧運動大鼠股四頭肌過氧化應激及JNK表達中的作用

秦春霞，錢海，車力龍，秦從軍，陳謙，肖德生

(1.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013;2.廣州醫學院公共衛生與全科醫學學院，廣東廣州510182)

一氧化氮在有氧運動大鼠股四頭肌過氧化應激及JNK表達中的作用

秦春霞1，錢海1，車力龍1，秦從軍1，陳謙1，肖德生2

(1.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013;2.廣州醫學院公共衛生與全科醫學學院，廣東廣州510182)

目的:探討有氧運動后一氧化氮(NO)對股四頭肌的過氧化應激及MAPK通路的調控作用。方法:大鼠分為靜息組(SED)、運動組(EXE)、靜息+NOS抑制組(SED－LNAME)、運動+NOS抑制組(EXE－LNAME)。運動組及運動+NOS抑制組每周連續游泳5d。共持續3個月。觀察大鼠股四頭肌MDA、SOD、TAOC及JNK水平的變化。結果:與SED組比較，EXE組大鼠股四頭肌SOD、TAOC、p－JNK蛋白顯著升高，在應用L－NAME干預后，運動+NOS抑制組MDA升高，SOD、TAOC、p－JNK顯著下降，t－JNK無顯著性變化。結論:運動訓練誘導產生的NO可能介導JNK信號激酶誘導抗氧化酶產生，從而提高骨骼肌的抗氧化能力。

運動;抗氧化;NO;JNK

有氧運動時肌組織血流量和氧消耗增多，自由基生成增多，引起過氧化應激反應，同時骨骼肌抗氧化機制增強，從而對肌肉發揮保護作用。NO以多種形式保護細胞免受過氧化損傷，包括與多種脂質過氧化產物以近擴散速率進行反應，阻止脂質過氧化鏈，甚至抑制細胞凋亡［1］。運動期間NO還能激活NF－κB DNA結合物，促進Mn－SOD，iNOS和eNOS的表達［2］。運動可通過激活大鼠骨骼肌細胞MAPK通路(ERK1/2、JNK、P38)，參與過氧化應激機制［3，4］，其中運動后股四頭肌NO水平升高，是否通過JNK通路調控對氧化應激發揮調節作用?本研究對此加以探討。

1 研究方法

1.1 實驗動物與分組

雌性SD大鼠40只，由江蘇大學實驗動物中心提供，飼養于帶不銹鋼底的標準大鼠籠內，室溫(23±1)℃，相對濕度(50±5)%，12h/12h光－暗節律。40只大鼠隨機分為靜息組(SED)、運動組(EXE)、靜息+NOS抑制組(SEDLNAME)、運動+NOS抑制組(EXE－LNAME)，每組10只。靜息+NOS抑制組和運動+NOS抑制組均以灌胃的方式給予一氧化氮合酶拮抗劑(L－NG－nitro－arginine methyl ester，LNAME，1mg/ml)的蒸餾水。大鼠飼料為AIN－93標準飼料，由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。

1.2 運動方法

運動組和運動+NOS抑制組大鼠在80cm×50cm×80cm的玻璃水缸中游泳，水深50cm，水溫(34±1)℃。每周連續游泳5d，休息1d，1次/d。每次游泳持續時間為第1周30min，第2周1h，第3周開始固定為2h，共持續3個月。靜息組和靜息+NOS抑制組除運動以外，其余處理與相應的運動組相同。

1.3 動物處理

大鼠在禁食12～24h后，用乙醚麻醉斷頭放血。迅速取其股四頭肌，液氮速凍，存放于－70℃待測。

1.4 分析方法

采用BCA法測蛋白含量，硫代巴比妥酸TBA比色法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化岐化酶SOD活力，比色法測定總抗氧化能力T－AOC，硝酸還原酶法測定NO，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，蛋白免疫印跡法測定JNK水平，實驗操作嚴格按說明書進行。

1.5 統計方法

實驗數據用均數±標準差表示，統計學處理采用SPSS 16．0統計軟件進行雙因素方差分析和組間比較。

2 結果

2.1 NO含量的變化

如圖1所示，與靜息組相比，運動組NO含量顯著升高(P＜0.01)，表明運動可升高股四頭肌內NO含量;靜息+NOS抑制組NO含量無顯著性差異。表明了內源性NOS的活性受到抑制。運動+NOS抑制組NO含量低于運動組(P＜0.05)，表明一氧化氮酶抑制劑在運動期間抑制了運動誘導的股四頭肌NOS活性的升高。

圖1 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌NO含量的影響注:a表示P＜0.01vs SED;b表示P＜0.05vs EXE，下同。

2.2 MDA水平的變化

如圖2所示，與靜息組相比，運動組MDA水平有降低趨勢但無顯著性差異(P＞0.05)。運動組+NOS抑制組MDA水平高于運動組(P＜0.05)，表明運動期間一氧化氮合酶抑制劑干預后，股四頭肌脂質過氧化水平升高。

2.3 SOD水平的變化

如圖3所示，與靜息組比較，運動組SOD含量升高(P＜0.05)，表明運動可升高股四頭肌SOD含量;靜息+NOS抑制組無顯著性差異。運動+NOS抑制組SOD水平低于運動組(P＜0.05)，表明在運動期間一氧化氮合酶抑制劑干預后，股四頭肌SOD含量降低。

2.4 TAOC水平的變化

如圖4所示，與靜息組比較，運動組TAOC水平顯著升高(P＜0.01)，表明運動后股四頭肌TAOC含量升高;靜息+NOS抑制組差異無顯著性意義;運動+NOS抑制組低于運動組(P＜0.05)，表明在運動期間一氧化氮合酶抑制劑干預后，股四頭肌TAOC水平下降。

圖2 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌MDA含量的影響

圖3 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌SOD含量的影響

圖4 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌TAOC水平的影響

2.5 p－JNK表達的變化

如圖5所示，與靜息組比較，運動組JNK水平顯著升高(P＜0.01)，表明運動可升高股四頭肌JNK蛋白表達水平;應用L－NAME干預后，靜息+NOS抑制組差異無顯著意義，運動+NOS抑制組顯著降低(P＜0.01)，表明在運動期間給予一氧化氮合酶抑制劑干預后，股四頭肌P－JNK蛋白表達水平降低。

2.6 t－JNK表達的變化

如圖6所示，與靜息組比較，運動組t－JNK蛋白表達水平無顯著差異。應用L－NAME干預后，靜息+NOS抑制組和運動+NOS抑制組沒有顯著性變化，表明運動訓練及LNAME對大鼠股四頭肌t－JNK蛋白表達水平無影響。

圖5 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌p－JNK水平的影響

圖6 游泳運動及L－NAME對大鼠股四頭肌t－JNK水平的影響注:1:SED;2:EXE;3:SED－LNAME;4:EXE－LNAME

3 討論

早期研究已證明游泳三個月后大鼠腓腸肌GSH含量顯著降低，MDA無顯著變化［5］。大量研究發現，有氧運動提高機體清除自由基的能力和降低骨骼肌自由基［6］。有氧運動增加血清和腓腸肌TAOC，減小脂質過氧化水平［7，8］。本研究結果說明，運動訓練后大鼠股四頭肌SOD、TAOC升高，MDA沒有顯著性改變，表明自由基的產生與清除處于動態平衡，抗氧化酶活性增強，機體的抗氧化能力提高，骨骼肌對運動產生了適應性。股四頭肌與報道中的腓腸肌的抗氧化差別可能包括運動對象、運動時間、運動強度、機制的不同。

NO與體內的氧、超氧陰離子、血紅蛋白等發生氧化反應形成穩定的硝酸鹽或亞硝酸鹽，以多種方式保護細胞免受過氧化損傷。NO與多種脂質過氧化產物以近擴散速率進行反應，阻止脂質過氧化鏈，甚至抑制細胞凋亡［1］。同時NO還促進線粒體的增多和增大［9］，長期有氧運動訓練使線粒體產生適應性變化，線粒體數目增多、酶合成增加、活性提高。研究表明，運動中產生的RON能激活NF－κB DNA結合物，促使腓腸肌中Mn－SOD，iNOS和eNOS的表達［2］。本研究觀察到，運動后股四頭肌氧化指標無顯著性變化，抗氧化能力提高，同時p－JNK表達升高，但是在NOS表達受抑制時，使NO產生減少，氧化損傷增加，抗氧化能力減弱，p－JNK表達降低。說明運動后誘導產生的NO水平影響了抗氧化酶的活性，同時NO可能介導了JNK的磷酸化過程。因此，可以認為運動產生的NO分子可能通過增加JNK磷酸化表達，上調抗氧化酶基因表達和調節參與運動訓練的蛋白表達，從而使機體對運動訓練產生生理適應性。

運動激活JNK活性，并促進c－Jun的表達與磷酸化［10］。運動形式、運動對象、運動強度不同，JNK活性程度也不同。江鐘立等研究顯示急性等張運動可以使股四頭肌的JNK活性升高4．1倍，而三周運動訓練使JNK活性更高。提示運動對肌肉蛋白代謝的調節機制與JNK激活的活性有關［11］。人及大鼠的股外側肌急性運動后，JNK活性顯著升高并且上調了c－Jun mRNA的表達，且認為運動誘導的JNK信號激活是肌肉收縮的內在反應，急性運動訓練表現為骨骼肌蛋白降解的一過性增多，而運動訓練反應表現為蛋白合成的增加和基因表達的改變［10］。

運動產生的多種抗氧化蛋白與JNK通路相關。運動訓練提高了HO－1水平，同時HO－1還可以調節細胞內鐵貯存和增加鐵排出，進而阻止游離鐵通過Harber－weiss反應產生羥自由基而造成組織損傷［12］。JNK參與了HO－1的信號通路，保護內皮細胞免受損傷［13］。研究表明HSP72在骨骼肌表達是骨骼肌自身的內源性保護機制［14］，HSP72可誘導SOD活性增加，對保護細胞免受自由基損傷起重要的作用［15，16，17］。運動能夠誘導骨骼肌表達IL－6［18，19］，在肌肉收縮時IL－6通過上游NF－κB和JNK被激活［20，21］。最新研究發現，運動肌肉中產生的NO增加了IL－6，IL－8，HO－1，HSP72蛋白的表達，并且在應用L－NAME干預后都發生了逆轉［22］。說明NO參與調控了骨骼肌中抗氧化相關蛋白的表達。JNK信號通路誘導抗氧化酶的研究未見報道，本研究證明，NO可以對抗運動對骨骼肌脂質過氧化損傷，JNK信號通路可能參與抗氧化酶的產生，但是JNK與NO介導的信號通路之間的關系需要進一步研究。

綜上所述，運動骨骼肌中NO生成增多，而NO直接或者間接的與細胞因子作用對抗機體脂質過氧化損傷，并且可能調控骨骼肌JNK信號通路，誘導骨骼肌抗氧化蛋白及酶的表達。使其適應運動所產生的各種生理變化，而對于NO對骨骼肌運動適應性精確的信號調節機制仍需要進一步研究。

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責任編輯:喬艷春

Role of Nitric Oxide in Oxidative Stress and JNK Expression of Quadriceps Femoris of Rats in Aerobic Exercise

QIN Chunxia1，QIAN Hai1，CHE Lilong1，QIN Congjun1，CHEN Qian1，XIAO Desheng2
(1.School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China;2.School of Public Health and General Practice，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，Guangdong，China)

Objective:To investigate the role of NO(nitric oxide)in oxidative stress and the MAPK pathways of quadriceps femoris in long-term aerobic exercise．Methods:Rats were divided into a sedentary group(SED)，an exercise group(EXE)，a sedentary plus L-NAME group(SED-LNAME)and an exercise plus L-NAME group(EXE-LNAME)．The rats in the EXE group and EXE plus LANME group swam for 5 days in a week，lasting for 3 months，and then the levels of MDA(malonaldehyde)，SOD(Superoxide Dismutase)，TAOC(total antioxidant capacity)and JNK(c-Jun N-terminal kinase)in the quadriceps femoris were analyzed．Results:Compared with the sedentary group，the contents of SOD，TAOC and p-JNK(phosphorylation-JNK)of the exercise group were significantly increased in quadriceps femoris．Treatment with L-NAME led to an increase in the MDA content，a significant decrease in the SOD，TAOC and p-JNK levels，without significant changes of the level of t-JNK in the EXE-LNAME group．Conclusion:During long-term aerobic exercise，NO may improve antioxidant capacity in skeletal muscle by increasing antioxidant enzymes activities，possibly through activating the JNK pathway．

exercise;antioxidant;NO;JNK

G804．23

A

1004－0560(2011)01－0058－04

2010-12-20;

2011-01-05

國家自然科學基金項目(30570894，30270639)。

秦春霞(1986－)，女，碩士研究生，主要研究方向為營養學及運動生理學調控機制。

肖德生(1961－)，男，教授，博士生導師，主要研究方向為營養學。